Blut

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 517 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Dermanyssus gallinae ist eine blutsaugende Milbe, die Wildvögel und Nutzgeflügel parasitiert. Ihre bemerkenswert schnelle Verarbeitung von Blut sowie die Fähigkeit, sich während der meisten Entwicklungsstadien mit Blut zu ernähren, machen diese Milbe zu einem äußerst schwächenden Schädling. Um spezifische Anpassungen an die Verdauung einer hämoglobinreichen Ernährung zu identifizieren, konstruierten und verglichen wir Transkriptome aus ausgehungerten und bluternährten Stadien des Parasiten und identifizierten mit dem Mitteldarm angereicherte Transkripte. Wir stellten fest, dass Mitteldarmtranskripte, die für Cysteinproteasen kodieren, durch eine Blutmahlzeit hochreguliert wurden. Bei der Kartierung des gesamten proteolytischen Apparats stellten wir eine Verringerung der Reihe von Cysteinproteasen fest, wobei Homologe für Cathepsin B und C fehlten. Wir haben außerdem drei verschiedene Transkripte identifiziert und phylogenetisch analysiert, die für Vitellogenine kodieren, die die Fortpflanzungsfähigkeit der Milben fördern. Wir haben auch Transkripte für die Häm-Biosynthese und das Ferritin-basierte System der Eisenspeicherung und des Transports zwischen Geweben vollständig kartiert. Darüber hinaus identifizierten wir Transkripte, die für Proteine ​​kodieren, die an der Immunsignalisierung (Toll- und IMD-Signalwege) und -aktivität (Defensine und Thioester-haltige Proteine), RNAi und Ionenkanalisierung (mit Zielen für kommerzielle Akarizide wie Fluralaner, Fipronil und Ivermectin) beteiligt sind. Virussequenzen wurden aus den Illumina-Reads herausgefiltert und wir beschrieben teilweise das RNA-Virom von D. gallinae mit der Identifizierung eines neuen Virus, Red Mite Quaranjavirus 1.

Die Dermanyssus-Milben sind blutsaugende Ektoparasiten von Vögeln1. Die Geflügelmilbe (D. gallinae) ist ein globaler Schädling in Legehennenställen sowohl für die häusliche als auch für die gewerbliche Eierproduktion2,3,4 und Teil eines wichtigen und ständig wachsenden globalen Marktes5. D. gallinae-Milben haben einen sehr kurzen Lebenszyklus und gelangen innerhalb einer Woche vom Jugendstadium zum reifen Erwachsenenstadium. Die Notwendigkeit, sich in den meisten Entwicklungsstadien mit Blut zu ernähren, und die schnelle Fortpflanzungsdynamik machen D. gallinae zu einem äußerst irritierenden und lästigen Schädling. Während der Blutfütterung können D. gallinae-Milben mehrere bedeutende tierische Krankheitserreger auf ihre Wirte übertragen6, darunter auch einige, die zoonotisch sind7. Obwohl eine große Anzahl von Viren und Bakterien im Zusammenhang mit D. gallinae gefunden wurde, wurde seine Fähigkeit, als Vektor oder Reservoir zu fungieren, nur für wenige Krankheitserreger experimentell bestätigt8,9,10. Dies ist besonders besorgniserregend im Hinblick auf die Übertragung von Salmonella spp.10, die eiassoziierte Salmonellose und Geflügeltyphus11 sowie die Ausbreitung des Vogelgrippe-A-Virus12 verursacht. D. gallinae wurde auch mit mehreren anderen Bakterien- und Virusarten in Verbindung gebracht, wobei der Nachweis seiner Vektorkapazität auf die experimentelle Bestätigung wartet2,10,13,14.

Trotz des allgemeinen Wissens über die globalen Auswirkungen des Milbenbefalls auf das Wohlergehen von Hühnern in der Eierproduktion ist unser Verständnis der molekularen Prozesse, die eine schnelle und wiederholte Bluternährung, Blutverdauung, Entwicklung und Fortpflanzung ermöglichen, nach wie vor unzureichend. Frühere transkriptomische Studien beschrieben Transkriptome ganzer Körper von D. gallinae-Milben, meist in einer entwicklungsstadiums- oder ernährungsstatusspezifischen Weise15,16,17,18. Um unser Wissen weiter zu erweitern, wollten wir mitteldarmspezifische Transkripte identifizieren, die für Proteine ​​kodieren, die für eine erfolgreiche Bluternährung und Verdauung von entscheidender Bedeutung sind. Um dies zu erreichen, verglichen wir neu sequenzierte und zusammengesetzte Transkriptome und selektierten anschließend nach Transkripten, die mit blutgefütterten gegenüber nicht gefütterten Milben angereichert waren und eine klare darmspezifische Expression aufwiesen. Besonderes Augenmerk wurde auf Prozesse gelegt, die für erfolgreiche Blutfütterer inhärent sind, einschließlich der enzymatischen Verdauung von Wirtsblutproteinen, der Häm- und Eisenbiologie, der Vitellogenese und der angeborenen Immunität. Die RNA-seq-Daten wurden dann durch RT-qPCR an cDNA-Sets verifiziert, die aus mehreren unabhängigen biologischen Replikaten hergestellt wurden. Darüber hinaus haben wir die RNA-seq-Datenanalyse durch mehrere Bioassays ergänzt, bei denen niedermolekulare Inhibitoren durch Ex-vivo-Membranfütterung oder Mikroinjektion in ihr Hämocoel in die Milbe eingeführt wurden, um die Bedeutung ausgewählter Moleküle und Signalwege zu verstehen. Darüber hinaus wurden Illumina-Reads viralen Ursprungs herausgefiltert und für einen teilweisen Zusammenbau des Milben-RNA-Viroms verwendet.

Die Transkriptomzusammensetzung von vier Entwicklungsstadien von dreißig Individuen von D. gallinae-Milben oder deren mikrosezierten Mitteldärmen wurde in dieser Arbeit (Abb. 1a) durch De-novo-Assemblierung von Illumina-RNA-seq-Reads untersucht. Konkret haben wir fünf RNA-seq-Bibliotheken erstellt, die aus ganzen Körpern von nicht ernährten Protonymphen (UP, ausgehungerten Individuen) und blutgenährten Protonymphen (FP) stammen, d der Transkriptregulation als Reaktion auf die Blutfütterung des Wirts (Abb. 1b). Ergänzt wurden diese durch gefütterte Deutonymphen und Erwachsene sowie Mitteldärme, die von bluternährten Erwachsenen präpariert wurden (Abb. 1b). Für jede Bibliothek wurden > 54 M Lesevorgänge mit Phred-Scores von Q30 ≥ 93,90 % erhalten, und diese wurden zu 85.117 Contigs zusammengefasst (Ergänzungstabelle S1). Nach ihrer Anmerkung wurden bakterielle Verunreinigungen entfernt (Ergänzungstabelle S2). Da D. gallinae-Milben mit Hühnerblut gefüttert wurden, das aus kernhaltigen weißen und roten Blutkörperchen bestand, stammten 4 % der Gesamtwerte aus Hühnern, von denen (79 %) erwartungsgemäß im Mitteldarmtranskriptom gefunden wurden (ergänzende Abbildung S1). ). Die identifizierten Hühnersequenzen wurden herausgefiltert und von den folgenden Analysen ausgeschlossen. Insgesamt 18.101 D. gallinae-spezifische Contigs wurden auf dem NCBI-Server als BioProject PRJNA597301 und Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) GIFZ00000000 hinterlegt und sind über NCBI BLAST der TSA-Datenbank zugänglich. Die Contigs werden auch in einer per Hyperlink verknüpften Excel-Tabelle (siehe „Datenverfügbarkeit“) mit den verfügbaren codierten vorhergesagten Proteineigenschaften, Anmerkungen zu zusammengesetzten Contigs gemäß einer bestimmten Datenbank, Statistiken zur differentiellen Expression und vorhergesagten zellulären Prozessen aufgelistet. Um die Vollständigkeit des Transkriptoms zu beurteilen, führten wir eine BUSCO-Analyse des Proteoms durch, deren Ergebnis eine Ausbeute von 91,8 % vollständiger BUSCOs ergab. Die aus D. gallinae-spezifischen Contigs erstellte Wärmekarte zeigte deutlich Unterschiede zwischen Transkriptomen im unreifen und erwachsenen Stadium und verdeutlichte auch Unterschiede in der Häufigkeit von Transkripten bei mit Blut gefütterten gegenüber nicht gefütterten Milben (ergänzende Abbildung S1).

eine schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs dieser Arbeit. b Mikrofotografische Darstellung repräsentativer Individuen, sortiert nach Entwicklungsstadium.

Um blutfütterungsassoziierte Transkripte zu identifizieren, haben wir Transkriptome von blutgefütterten und UP-Transkriptomen verglichen (Abb. 2a), die sich aus nicht ernährenden Larven entwickelt haben, also einem Entwicklungsstadium, das noch nicht mit Blut in Kontakt gekommen ist. Um Transkripte zu identifizieren, die Schlüsselproteine ​​für die Bluternährung von Milben kodieren, haben wir Transkripte gefiltert, die in Blut-FP mindestens 16-mal häufiger vorkommen als in UP. Insgesamt handelte es sich um 906 Transkripte (Abb. 2a). Diese Transkripte wurden weiter für diejenigen angereichert, die in der transkriptomischen Bibliothek des Mitteldarms mindestens einen FPKM-Wert von 1 aufwiesen. Auf diese Weise identifizierten wir 264 Transkripte (Abb. 2a), von denen wir glauben, dass sie für mit der Bluternährung assoziierte Proteine ​​kodieren. Die Genontologie weist auf eine Anreicherung der Signalübertragung, der nuklearen Expressionsregulation und der Proteostase hin, wobei die extrazelluläre Matrix und die Signalübertragung die am häufigsten vorkommenden Transkripte umfassen (Abb. 2b). Zu den am unterschiedlichsten exprimierten Transkripten (DETs) gehören sekretierte Metallocarboxypeptidase (M14-Protease), Cysteinproteasen (Cathepsin L5 und Legumain 4), Serinprotease (Stubble) und extrazelluläre Strukturglykoproteine ​​wie Kutikulaprotein, Mucin und Peritrophine (Abb. 2c). Um die FPKM-Werte der Transkriptexpression für einen statistisch aussagekräftigen quantitativen Vergleich zugänglich zu machen, wurden die Transkriptome durch quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) anhand unabhängiger Vorlagen von mindestens vier biologischen Replikaten validiert (siehe unten). Die RT-qPCR-Analyse bestätigte die Regulierung der Bluternährung, wobei die meisten Transkripte bei mit Blut gefütterten Milben im Vergleich zu nicht gefütterten Milben deutlich hochreguliert waren (Abb. 2c‘). Um weitere Einblicke in Mitteldarm-spezifische Prozesse zu erhalten, haben wir unterschiedlich exprimierte Mitteldarm-Transkripte ausgewählt, die eine fache Änderung der FPKM-Werte der Mitteldarm-Expression im Vergleich zum gesamten Körper erwachsener Menschen zeigen. Transkripte mit der tiefsten mitteldarmspezifischen Expression sind diejenigen, die für Proteasen, Ferritin 2 (eisenbindendes Protein), Ferrochelatase (ein terminales Enzym der Häm-Biosynthese) und Hämolymphe transportierendes Lipoglykoprotein kodieren (Abb. 2d). Diese DETs wurden erneut durch unabhängige RT-qPCR bestätigt (Abb. 2d '). Diese Daten unterstreichen die proteolytische Verdauung und die Metallhomöostase (Metallostase) als Schlüssel zum Erfolg der Bluternährung von D. gallinae-Milben.

a Venn-Diagramme zeigen eine Überlappung der Zusammensetzung mit Transkripten, die mit gefütterten Protonymphen angereichert sind, >16-fache FPKM-Werte im Vergleich zu nicht gefütterten Protonymphen und mit Transkripten mit FPKM ≥ 1 im Mitteldarm. b Das Balkendiagramm zeigt Proteinklassen, die durch einzelne, durch Blutfütterung angereicherte Transkripte kodiert werden. Die Transkripte wurden nach der kodierten Proteinklasse sortiert. Die Anzahl der Transkripte aus jeder Unterklasse und ihre FPKM-Werte werden angezeigt. c Die Tabelle zeigt die höchsten differenziell exprimierten Transkripte (DET), angereichert mit >16-fachen FPKM-Werten, in Transkriptomen von mit Blut gefütterten Protonymphen (FP) im Vergleich zu Transkriptomen von nicht gefütterten Protonymphen (UP). Einzelne Zugangs-IDs sind in der Ergänzungstabelle S3 verfügbar. c' RT-qPCR-Validierung von DETs, die durch die in Panel (c) gezeigten RNA-seq-Daten identifiziert wurden. Die Daten wurden aus cDNA-Sätzen erhalten, die aus drei unabhängigen RNA-Isolaten von nicht gefütterten und mit Blut gefütterten Milben (n = 3) synthetisiert und auf den Elongationsfaktor 1 (ef1α) normalisiert wurden. Mittelwerte und SEMs werden angezeigt. d Die Tabelle zeigt DETs, die an Transkriptomen des Mitteldarms im Vergleich zu Transkriptomen ganzer Körper angereichert sind, mit angewendeten Filtern: Eval < e−60, Abdeckung ≥ 90 %, FPKMadults ≥ 2. Einzelne Zugangs-IDs sind in der Ergänzungstabelle S4 verfügbar. d' RT-qPCR-Validierung von DETs, die durch die in Panel (d) gezeigten RNA-seq-Daten identifiziert wurden. Die Daten wurden aus cDNA-Sätzen gewonnen, die aus mindestens vier unabhängigen RNA-Isolaten erwachsener Weibchen und mikroseziertem Mitteldarm erwachsener Weibchen (n ≥ 4) synthetisiert und auf ef1α normalisiert wurden. Mittelwerte und SEMs werden angezeigt. t-Test-Analysen: *p = 0,05–0,01; **p = 0,01–0,001; ***p = 0,0008; ****p < 0,0001; ns nicht signifikant. Die Quelldaten hinter den Diagrammen finden Sie unter Ergänzende Daten S1.

Mitteldarmproteasen stellen eindeutig eine wichtige Enzymgruppe dar, die eine schnelle Blutverarbeitung ermöglicht. Um ein vollständiges Repertoire des proteolytischen Verdauungssystems von D. gallinae offenzulegen, haben wir die transkriptomischen Bibliotheken durchsucht und Transkripte identifiziert, die für Proteasen einzelner Protease-Clans und -Familien kodieren. Es wurde festgestellt, dass Cysteinproteasen (hauptsächlich die Papain-Familie) von der Mehrzahl der identifizierten Mitteldarm-Reads kodiert werden, was etwa 62 % aller Protease-kodierenden Reads ausmacht (ergänzende Abbildung S2). Unter den 10 identifizierten Cysteinproteasen befanden sich sechs kodierte Cathepsin-L-ähnliche Moleküle (Clan CA, C1-Familie) und vier kodierte Legumaine (Asparaginyl-Endopeptidasen; Clan CD, C13-Familie) (Abb. 3a, b). Cathepsin L5 und Legumain 4 wurden durch Blutfütterung stark hochreguliert und schienen hauptsächlich im Mitteldarm erwachsener D. gallinae exprimiert zu werden, was auf ihre direkte Beteiligung an der Blutverdauung des Wirts im Mitteldarm der Milbe hinweist. Es wurden drei Aspartylproteasen (AP) vom Cathepsin-D-Typ (Clan AA, A1-Familie A1) mit einem im Mitteldarm angereicherten Expressionsmuster identifiziert (Abb. 3b). Interessanterweise wurden in den Transkriptomen von D. gallinae keine Homologen der wichtigsten Papain-ähnlichen Proteasen Cathepsine B und C (Dipeptidylpeptidase I) identifiziert, die an der Blutverdauung bei Zecken und anderen blutsaugenden Parasiten beteiligt sind (Abb. 3a). Ihr Fehlen scheint ein gemeinsames Merkmal von Mesostigmatmilben zu sein (Abb. 3a), was darauf hindeutet, dass die Bluternährung bei D. gallinae-Milben vor dem molekularen Hintergrund eines Enzymrepertoires ohne Cathepsin B und C auftritt, d unverzichtbar für die Blutverdauung bei parasitären Arten21.

a Identifizierung von Verdauungsprotease-Homologen im Transkriptom von Dermanyssus gallinae (Dg) (hervorgehoben durch ein rot gestricheltes Rechteck) und Vertretern von Cheliceraten; Lp, Limulus polyphemus; Pt, Parasteatoda tepidariorum (ein Vertreter von Araneae); Tu, Tetranychus urticae; Ss, Sarcoptes scabiei; Ist Ixodes scapularis; Rm, Rhipicephalus microplus; Mo, Metaseiulus occidentalis; Vd, Varroa-Zerstörer; Nc, Neoseiulus cucumeris. Grüne Rechtecke zeigen das Vorhandensein und weiße Rechtecke das Fehlen einer homologen Identifizierung an, wobei die Schwellen-E-Werte auf ≥1e−30 eingestellt sind. Einzelheiten zu den Einstellungen und Ergebnissen der Explosionssuche sind in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt. b Eine Liste ausgewählter Proteasen und Expressionswerte (FPKM) ihrer mRNA-Transkripte in Bibliotheken, die aus einzelnen Entwicklungsstadien von D. gallinae stammen. Einzelne Zugangs-IDs sind in der Ergänzungstabelle S5 verfügbar. UP-nicht gefütterte Protonymphen, FP-gefütterte Protonymphen, FD-gefütterte Deutonymphen, WB-ganze Körper. Die Ausdrucksvarianz für jedes Transkript wird durch Farben angezeigt, die von niedrig (blau) bis hoch (rot) reichen.

Das Wirtsblut ist nicht nur proteinreich, sondern auch eine reichhaltige Quelle für Häm- und Nicht-Häm-Eisen. Die mitteldarmspezifische Expression von Transkripten, die Proteine ​​kodieren, die an der Häm- oder Eisenbiologie beteiligt sind, z. B. Ferrochelatase, Ferritin 2 (Abb. 2d, d'), bestätigt deren Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Metallostase im Mitteldarm von D. gallinae-Milben. Im Gegensatz zu Zecken, die kein Häm de novo synthetisieren können und Häm aus dem Hämoglobin des Wirtsbluts aufnehmen müssen22, zeigten D. gallinae-Milben eindeutig die Fähigkeit, Häm de novo zu synthetisieren. Wir identifizierten Transkripte, die ein vollständiges enzymatisches Profil für die Hämbiosynthese kodieren, einschließlich des im Mitteldarm angereicherten Ferrochelatase-Transkripts (Abb. 4a). Um die Aktivität dieses Weges weiter zu demonstrieren, identifizierten wir in Homogenaten von nicht gefütterten Stadien von D. gallinae stabile Zwischenprodukte der Hämbiosynthese, entweder durch Standards (Abb. 4b) oder durch genaue Massenbestimmung (Coproporphyrinogen III; ergänzende Abb. S3a). Das Endprodukt des Weges, Häm b, wurde durch Vergleich mit dem Hämin-Standard identifiziert, wobei [M + 2]+ als diagnostisches Ion in seinem Massenspektrum (ergänzende Abbildung S3b) war, was auf einen vollständig aktiven Häm-Biosyntheseweg hinweist (Abb . 4c). Darüber hinaus produzieren D. gallinae-Milben farblose Eier ohne Ablagerungen von mütterlichem Häm (Abb. 4d), was das Konzept der aktiven Häm-Biosynthese gegenüber der somatischen Verteilung und Ablagerung von Häm aus der Nahrung, wie sie bei Zecken durchgeführt wird, bevorzugt22. Dies liefert einen weiteren Beweis für einen Unterschied in der Hämbiologie von Zecken23 und D. gallinae-Milben, obwohl beide stammesgeschichtlich verwandte, obligatorische Blutspender sind.

eine Tabelle der Proteine, die an der Häm- (links) oder Eisenhomöostase (rechts) beteiligt sind, zusammen mit ihren Expressionswerten (FPKM) ihrer mRNA-Transkripte in Bibliotheken, die aus einzelnen Entwicklungsstadien von Dermanyssus gallinae stammen. Die Zugangsnummern finden Sie in der Ergänzungstabelle S6. UP-nicht gefütterte Protonymphen, FP-gefütterte Protonymphen, FD-gefütterte Deutonymphen. leider 5-Aminolevulinat-Synthase; pbgs, Porphobilinogen-Synthase; hmbs, Hydroxymethylbilan-Synthase; Uros, Uroporphyrinogen-Synthase; Urod, Uroporphyrinogen-Decarboxylase; cpox, Coproporphyrinogenoxidase; ppox, Protoporphyrinogenoxidase; Fech, Ferrochelatase; ho, Häm-Oxygenase; Fer, Ferritin; tf, Transferrin; irp, Eisen-responsives Protein. b Die LC/MS-Analyse von Häm b-Vorläufern in den naiven, nicht gefütterten Stadien von D. gallinae. Oben werden rekonstruierte Chromatogramme für die D. gallinae-Proben angezeigt, unten rekonstruierte Chromatogramme für ihre Analysestandards. c Ein Schema der Häm-Biosynthese, das (ausgefüllte Kreise) Transkripte und Metaboliten des Stoffwechselwegs identifiziert. ALA δ-Aminolävulinsäure, PBG-Porphobilinogen, HMB-Hydroxymethylbilan, URO-Uroporphyrinogen, CPP-Coproporphyrinogen, PP-Protoporphyrin. d Ein fotografisches Bild von Eiern von D. gallinae-Milben und Ixodes ricinus-Zecken; Beachten Sie den Farbunterschied, der auf das Fehlen/Vorhandensein mütterlicher Hämablagerungen hinweist.

Ähnlich wie Zecken und andere Milben22 kodieren D. gallinae-Milben nicht für Hämoxygenase (Abb. 4a), ein Häm-spaltendes Enzym, das bioverfügbares Eisen aus dem Porphyrinring freisetzt. Das über die Nahrung aufgenommene Eisen muss daher nicht aus Häm stammen. Bei der Aufnahme wird Eisen durch intrazelluläre Eisenbinder gebunden. Wir identifizierten zwei D. gallinae-Transkripte, die für große Eisen-bindende Ferritin-Komplexe kodieren. Das Transkript von Ferritin 1 (fer1) weist ein konserviertes auf Eisen reagierendes Element in der 5'UTR-Region auf (ergänzende Abbildung S4), was darauf hindeutet, dass seine posttranslationale Regulation von der Bioverfügbarkeit von Eisen abhängt. Darüber hinaus identifizierten wir ein zweites Ferritin-Transkript (fer2), das für Ferritin-Protein mit einem vorhergesagten Signalpeptid (DeepLoc: 0,77) am N-Terminus kodiert (ergänzende Abbildung S4), was auf seine Rolle beim Eisentransport zwischen Gewebe hinweist. Im D. gallinae-Transkriptom wurde nur ein einziges Homolog von Insekten-Typ-2-Transferrinen (Melanotransferrinen) identifiziert (Abb. 4a).

Wir identifizierten 7252 kodierende Sequenzen (65,2 %), die in allen Entwicklungsstadien gemeinsam sind (Abb. 5a), und diese stellen den transkriptomischen Kern der D. gallinae-Milben dar. Tatsächlich teilten unreife Stadien (Protonymphen und Deutonymphen) mehr Transkripte miteinander als alle unreifen Stadien mit Erwachsenen (Abb. 5a). In jedem Stadium wurden 4,4–5,5 % einzigartiger idiosynkratischer Transkripte exprimiert (Abb. 5a). Bibliotheken erwachsener Milben zeichneten sich durch eine große Menge an Transkripten aus, die für Proteine ​​kodieren, die an der Energieerhaltung (Argininkinase) und der Speicherung/Verteilung von Nährstoffen (Vitellogenine und Vitellogenin-Rezeptor; Abb. 5b) beteiligt sind. Unter Verwendung der Proteinprimärsequenzen von I. ricinus Vitellogenin 1 und 2 als tBlastN-Abfragen identifizierten wir innerhalb des adulten D. gallinae-Transkriptoms zwei Vitellogenin-Transkripte, die die Homologen von Zecken-Vitellogeninen22 kodieren, aber auch ein zusätzliches Vitellogenin-Transkript (Vitellogenin 1-like). Alle drei Transkripte zeigten deutlich erhöhte Werte in den Transkriptomen erwachsener Milben, wobei in den Transkriptomen juveniler Milben praktisch keine mRNA vorhanden war (Abb. 5b, b'). Das zusätzliche Transkript, das für bestimmtes Vitellogenin kodiert, scheint für Dermanyssoidea-Milben einzigartig zu sein und wird hier als Vg1-ähnlich bezeichnet (Abb. 5c, Ergänzungstabelle S8). Die phylogenetische Analyse von Arthropoden-Vitellogeninen ergab mehrere Vitellogenin-Kladen, die ihre taxonomische Gruppierung der Arthropoden widerspiegeln, d. Die Milben spalteten sich in zwei gut unterstützte Kladen auf, die Homologe der Parasitiformes (ML/BI = 95/1,00) und der Acariformes (ML/BI = 84/0,98) enthielten. Parasitiforme Sequenzen, die innerhalb der gut unterstützten Vg1- und Vg2-Linien (beide ML/BI = 100/1,00) geclustert sind und jeweils zwei Zecken und zwei bis drei Milbenhomologe umfassen. Die D. gallinae-Milbe Vg1 (Transkript IrSigP-350331_FR2_207-2055, Protein-ID: MBD2876257.1), Vg1-like (Transkript IrSigP-349783_FR3_1-1870, Protein-ID: MBD2876000.1) und Vg2 (Dg-9795_FR3_189-208). 9, Protein ID: MBD2876256.1), gruppiert mit ihren jeweiligen Milben-Vitellogenin-Orthologen innerhalb der entsprechenden Vg-Linien (Abb. 5c).

a Venn-Diagramme zeigen die stadienspezifischen transkriptomischen Eigenheiten sowie den transkriptomischen Kern, der in der gesamten Ontogenese gemeinsam ist. b Die Tabelle zeigt die Top-Transkripte, angereichert mit Transkriptomen erwachsener Milben. Diese wurden nach >16-fachen FPKM-Werten im Transkriptom von Erwachsenen gegenüber den Transkriptomen beider jugendlicher Milbenstadien, Protonymphen und Deutonymphen, gefiltert; und E-Wert < e−80; Protein-IDs sind als Ergänzungstabelle S7 verfügbar. b' RT-qPCR-Validierung von DETs, die durch die in Panel (b) gezeigten RNA-seq-Daten identifiziert wurden. Die Daten wurden aus cDNA-Sätzen erhalten, die aus drei unabhängigen RNA-Isolaten erwachsener und jugendlicher Milben (n = 3) synthetisiert und auf den Elongationsfaktor 1 (ef1α) normalisiert wurden. Mittelwerte und SEMs werden angezeigt. Die Quelldaten hinter der Grafik finden Sie unter Ergänzende Daten S1. FP ernährte sich von Protonymphen, FD ernährte sich von Deutonymphen. c Maximum-Likelihood-Phylogenie von 94 Arthropoden-Vitellogenin-Aminosäuresequenzen, die die Positionierung von drei D. gallinae-Vitellogenin-Homologen innerhalb der Vg1- und Vg2-Linien zeigt. Als Fremdgruppe wurden Krustentier-Vitellogenine verwendet. Knotenunterstützungen an den Hauptknoten werden durch Maximum-Likelihood-Bootstrap-Werte bzw. Bayes'sche Inferenz-Posteriori-Wahrscheinlichkeiten dargestellt. Zur Vereinfachung wurden die Homologen von nicht-parasitiformen Taxa in Dreiecke zusammengefasst; Zahlen innerhalb des Dreiecks geben die Anzahl der in jeder Gruppe enthaltenen Sequenzen an. Die GenBank-Zugangsnummern finden Sie in der Ergänzungstabelle S8.

Um zu beurteilen, ob D. gallinae-Milben den Fütterungsstatus über eine TOR-vermittelte Transduktionskaskade übermitteln, haben wir unter Verwendung von Caenorhabditis-Homologen als Abfragesequenzen24 unsere Transkriptome untersucht und die Expression des TOR-Komplexsystems sowie der Insulin/IGF-Signalisierung25 identifiziert, die über Entwicklungsstadien hinweg exprimiert wird ( Ergänzende Abbildung S5a). Wir untersuchten außerdem den Einfluss der TOR-vermittelten Signalübertragung auf die Lebensfähigkeit von Milben nach der Fütterung mithilfe eines Ex-vivo-Membranfütterungssystems26, indem wir erwachsene D. gallinae-Milben mit Hühnerblut fütterten, das mit Torin2, einem Inhibitor von TOR-Komplexen, ergänzt war27. Die resultierenden Daten zeigen, dass Torin2 bei hoher Inhibitordosis eine deutliche dosisabhängige Letalität nach der Blutfütterung verursachte (ergänzende Abbildung S5b), was auf eine mögliche Aktivität dieses Signalwegs nach der Fütterung bei erwachsenen Milben hinweist.

Die meisten im Handel erhältlichen Akarizide sowie Insektizide zielen auf das Nervensystem von Wirbellosen ab, meist durch Wechselwirkung mit einer allosterischen Stelle ionotroper Rezeptoren, auch Ligand-Gated Ion Channels (LGICs) genannt28. Mitglieder dieser Familie weisen ein hohes Maß an Primärsequenzähnlichkeit auf und bilden eine Ligandenbindungsstelle für Neurotransmittermoleküle und eine ionenleitende Pore. LGICs können in vier Hauptfamilien eingeteilt werden29, von denen eine eine Reihe validierter akarizider/insektizider Ziele umfasst, d. 31. Die Cys-Loop-Rezeptoren (cysLGICs) sind sowohl kationendurchlässig, wie z. B. nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChRs)32, Serotoninrezeptoren, als auch Rezeptoren, die Anionen leiten, wie z. B. γ-Aminobuttersäure (GABA)-gesteuerte Ionenkanäle33, Glycin Rezeptoren und Chloridkanäle, die durch Glutamat (GluCls), Histamin34,35 oder Zink36 gesteuert werden. Die letzten beiden, Histamin- und Zink-gesteuerte Chloridkanäle, wurden im Transkriptom von D. gallinae nicht identifiziert (Supplementary Data S2). Im Gegensatz zu einigen pentameren ligandengesteuerten Ionenkanälen kommen Homologe von RDL-GABA-Rezeptoren (Resistenz gegen Dieldrin)28 und GluCls nur bei Wirbellosen vor37. RDL-GABA und GluCls können von negativen Modulatoren wie Fipronil oder positiven Modulatoren wie Ivermectin38 angegriffen werden. Wir haben unser Transkriptom durchsucht (E-Wert < e−10, mit Pediculus sp.39 und Tetranychus sp.40 als Abfragen) und einen phylogenetischen Baum von Cys-Loop-Rezeptoren rekonstruiert, nachdem wir 29 Transkript-kodierende Mitglieder des Cys-Loops identifiziert haben Familie (Abb. 6a). Die D. gallinae-Transkripte gruppierten sich mit ihren jeweiligen Homologen von Arthropoden und Wirbeltieren in neun Klassen und in einer weiteren Gruppe, die ausschließlich die Acari-spezifischen Glutamat-gesteuerten Chloridkanal-ähnlichen Proteine ​​​​vereinigte. Beim Betrachten des Verhältnisses Mitteldarm/Ganzkörper haben wir vier weitere Transkripte mit einem im Mitteldarm angereicherten Vorkommen von mRNA-Transkripten herausgefiltert (Abb. 6b), eines für das pH-empfindliche Chloridkanalprotein und drei für Acari-spezifische Chloridkanal-ähnliche Proteine . Als nächstes identifizierten wir vier Transkripte, die für GluCls kodieren, von denen zwei eine mitteldarmspezifische Expression zeigten (Abb. 6c), wobei jedoch alle Transkripte einen GluCls-Kern mit der Cys-Loop-Region und größtenteils vier Transmembrandomänen gemeinsam hatten (ergänzende Abb. S6). Die Aminosäuresequenzanalyse von GluCls zeigte die Konservierung der meisten Aminosäurereste, die für die Ivermectin-Assoziation mit dem GluCl-Alpha-Kanal von C. elegans erforderlich sind (ergänzende Abbildung S6). Der Zusammenbau der vier GluCl-Homologen wurde durch mehrere Lesevorgänge unterstützt, mit Ausnahme des codierten C-Terminus des IrSigP-571488-Transkripts, der aus eindeutig zugewiesenen Lesevorgängen besteht (ergänzende Abbildung S7). Um die Empfindlichkeit von D. gallinae-Milben gegenüber Akariziden zu bestätigen, die auf GluCl-Kanäle abzielen, wie beispielsweise Fipronil, Ivermectin und Fluralaner, haben wir experimentell das dosisabhängige Überleben nach Mikroinjektion der jeweiligen Verbindungen in erwachsene Milben bestimmt (Abb. 6c'). . Während Ivermectin und Fluralaner bei Mikroinjektion einer 10-µM-Lösung innerhalb weniger Tage eindeutig tödliche Wirkungen hervorriefen, verursachte Fipronil selbst bei Injektion mit 100 µM nur eine vernachlässigbare Letalität (Abb. 6c').

ein phylogenetischer Maximum-Likelihood-Baum der Proteinsequenzen der cysLGIC-Untereinheit von Arthropoden und Wirbeltieren. Die Bootstrap-Unterstützungen über 50 % werden an den Hauptknoten angezeigt. Dermanyssus gallinae: Dg und IrSig (rot dargestellt), Tetranychus urticae: Tu, Drosophila melanogaster (D oder andere), Apis mellifera (Amel), Tribolium castaneum (Tcas), Homo sapiens (Hs), Danio rerio (Dr), Bos Taurus (Bt), Equus caballus (Ec), Sus scrofa (Ss) und Gallus gallus (Gg). Zugangsnummern finden Sie unter Supplementary Data S1. b FPKM-Werte einzelner Acari-spezifischer (Ac) und pH-abhängiger (pH) Chloridkanäle (Cls) und deren Verhältnis Mitteldarm/Ganzkörper (WB) erwachsener Milben. UP-nicht gefütterte Protonymphen, FP-gefütterte Protonymphen, FD-gefütterte Deutonymphen. c FPKM-Werte einzelner GluCls und deren Verhältnis Mitteldarm/Ganzkörper erwachsener Milben. c' Dosisabhängige Lebensfähigkeitstests nach Mikroinjektion von GluCls-Agonisten, gelöst in DMSO und verdünnt auf 1 % des Lösungsmittels. Jeder Datenpunkt stellt einen Mittelwert und SEM von n = 24 oder 25 Milben pro getesteter Konzentration dar. Die Quelldaten hinter den Diagrammen finden Sie unter Ergänzende Daten S1.

Die angeborene Immunität ist bei Metazoen stark konserviert und betrifft sowohl Wirbeltiere als auch Wirbellose42. Der humorale Teil der Immunität von Wirbellosen umfasst die Wahrnehmung des mikrobiellen Nicht-Selbst, gefolgt von der Signaltransduktion, hauptsächlich über Toll- und Imd-Signalwege, die bis zu einem gewissen Grad unabhängig voneinander funktionieren43. In unserer Arbeit haben wir das Transkriptom von D. gallinae untersucht und einen vollständigen Toll-Signalweg rekonstruiert, was auf die volle Funktionalität in D. gallinae schließen lässt (Abb. 7a). Die einzigen fehlenden Komponenten waren Gram-negative Bakterien-bindende Proteine ​​(GNBPs) und der Transkriptionsfaktor DIF. Peptidoglycan-Erkennungsproteine ​​(PGRPs) lagen in zwei verschiedenen Varianten vor, deren Klassifizierung unsicher war. Neun Spätzle-Proteine ​​und acht Toll-Rezeptoren wurden identifiziert. Der Imd-Signalweg war deutlich reduziert, da die meisten Komponenten fehlten, darunter IMD und Relish. Defensine sind wahrscheinlich die am weitesten verbreiteten antimikrobiellen Peptide mit 3–5 kDa, weit verbreitet im Tier- und Pflanzenreich44 und sind Effektormoleküle, die sowohl durch den Toll- als auch den IMD-Weg reguliert werden45. Wir haben nach Defensin-ähnlichen Molekülen im Transkriptom von D. gallinae gesucht und dabei Daten aus dem Genom der Zecke Ixodes scapularis verwendet, das mehrere Defensin-verwandte Moleküle kodiert, die in zwei Hauptfamilien unterteilt sind: (i) Scapularisine, die strukturell mit dem alten Defensin vom Wirbellosentyp verwandt sind und (ii) Scasine, die nur entfernt mit den kanonischen Defensinen verwandt sind46. Während wir kein Transkript im Zusammenhang mit dem I. scapularis-Scasin (Gen Bank EEC18782) finden konnten, identifizierten wir mehrere Defensin-ähnliche Moleküle im Zusammenhang mit den Scapularisinen mit der höchsten Homologie zu Scapularisin-6 (GenBank EEC08935), die in als Defensin-2 bezeichnet werden das I. scapularis-Genom (VectorBase ISCW005928). Sequenzen von acht D. gallinae-Transkripten, die mutmaßliche Defensine codieren, die mit Scapularisin-6 ausgerichtet sind (Abb. 7b), zeigten, dass D. gallinae-Defensine in zwei Haupttypen unterteilt werden können: (i) Typ-I-Defensine, denen das kanonische Furin-Spaltungsmotiv (RVRR) fehlt und (ii) Defensine vom Typ II, bei denen die Furinstelle konserviert ist. Basierend auf den FPKM-Werten scheinen Defensine vom Typ I in allen Stadien viel stärker exprimiert zu werden (Abb. 7b).

a Proteinsequenzen der Toll- und Imd-Pfade von Drosophila oder Tribolium wurden für die Suche in unserer D. gallinae-Datenbank für übersetzte Proteine ​​(Local BLAST, E-Wert 0,1, Matrix BLOSUM62) verwendet. Die Erhaltung der Domänen wurde durch CD-Suche (NCBI) überprüft. Als mutmaßliche Homologe wurden nur homologe Sequenzen mit ähnlichen Domänenstrukturen und einem E-Wert < 10e−3 angesehen. Die Zugangsnummern sind in der Ergänzungstabelle S9 verfügbar. b Mehrfachsequenz-Alignment der identifizierten reifen Defensine von D. gallinae, Homologie mit Zecken-Ixodes scapularis scapularisin-6 (GenBank EEC08935) und Expressionswerte (FPKM) von Defensin-Transkripten in Bibliotheken, die aus einzelnen Entwicklungsstadien von D. gallinae stammen. Die Aminosäurereste der Furin-Spaltstelle sind in roter Schrift dargestellt. UP-nicht gefütterte Protonymphen, FP-gefütterte Protonymphen, FD-gefütterte Deutonymphen.

Die Hauptrolle bei der zellulären und humoralen angeborenen Immunität von Wirbeltieren sowie wirbellosen Metazoen spielt das komplexe Komplementsystem48. Die zentralen Effektormoleküle der Komplementsysteme von Wirbeltieren und Wirbellosen sind Proteine, die zur Familie der thioesterhaltigen Proteine ​​(TEP) gehören und früher als Proteine ​​der α2-Makroglobulin-Superfamilie bezeichnet wurden48,49,50. Bei Wirbellosen besteht die TEP-Familie aus bis zu vier phylogenetisch unterschiedlichen Hauptgruppen, bestehend aus Pan-Protease-Inhibitoren des α2-Makroglobulin-Typs (α2M), C3-ähnlichen Komplementkomponenten (C3), TEPs vom Insektentyp (iTEPs) und Makroglobulin -Komplementbezogene (MCRs)51,52,53.

Hier untersuchten wir das D. gallinae-Transkriptom mit vollständigen Sequenzen von neun gut kommentierten Mitgliedern der I. ricinus-TEP-Familie, die alle vier Gruppen von Wirbellosen-TEPs repräsentieren52,54. BlastP-Mining und die folgenden phylogenetischen Analysen mit anderen ausgewählten Vertretern von TEPs von Wirbellosen ergaben, dass D. gallinae nur ein α2-Makroglobulinmolekül exprimierte, das von mindestens fünf Spleißvarianten (DgA2M (sv1–5)) kodiert wurde (Ergänzende Abbildung S8). ) innerhalb der Protease-sensitiven „Köderregion“. Darüber hinaus enthielt das Transkriptom von D. gallinae ein Molekül, das eindeutig zum TEP vom Insektentyp gehörte (DgTEP), ein C3-komplementähnliches Molekül (DgC3) und drei Moleküle, die zu dieser Gruppe gehörten von Makroglobulin-Komplement-verwandten Proteinen (DgMCR-1,2,3) (Ergänzende Abbildung S8). DgMCR-3 scheint phylogenetisch ziemlich weit von den beiden anderen, DgMCR-1 und DgMCR-2, entfernt zu sein, dennoch ist seine Zugehörigkeit dazu Die MCRs werden durch ihre stabile phylogenetische Positionierung innerhalb der MCR-Klade und durch das Vorhandensein der charakteristischen Lipoproteinrezeptordomäne niedriger Dichte im zentralen Teil des Moleküls unterstützt. 52, 54. Zusammengenommen besitzt D. gallinae Vertreter aller Hauptgruppen von Wirbellosen-TEPs , von denen die meisten erhebliche Unterschiede in ihrem Expressionsmuster aufweisen (ergänzende Abbildung S8).

Arthropoden55 sind, ähnlich wie höhere Organismen56, mit einem RNA-basierten Mechanismus der antiviralen Immunität ausgestattet, der als RNA-Interferenz (RNAi) bezeichnet wird. Dieser Weg wirkt sowohl gegen RNA- als auch gegen DNA-Viren bei Insekten57,58. Sowohl In-silico-Vorhersagen als auch experimentelle Validierung unterstützen das Vorhandensein eines funktionellen RNAi-Signalwegs in D. gallinae59. Wir haben die In-silico-Analyse59 bestätigt (ergänzende Abbildung S9) und die meisten Transkripte identifiziert, die für proteinhaltige RNAi-Komponenten kodieren, mit Ausnahme eines R2D2-Homologen (Eval-Grenzwert <0,00001; Abfrage Drosophila R2D2: NP_001285720.1). Es wird berichtet, dass R2D2, ein dsRNA-bindendes Protein, für das Laden von siRNAs in Effektor-Ago-RISC-Komplexe essentiell ist60. Dies steht im Einklang mit einer umfassenden phylogenetischen Analyse, die das Vorhandensein von R2D2-Homologen nur in Ordnungen geflügelter Insekten (Pterygota) feststellte, ihr Fehlen jedoch in Nicht-Insekten-Arthropoden (Zecken, Milben, Krebstiere)61.

Im Rahmen unseres Ziels, die vollständige RNA-Komponente von D. gallinae zu charakterisieren, haben wir unsere Suche auf eine Standardpipeline zur Entdeckung von Arthropodenviren ausgerichtet, um potenzielle virusähnliche Sequenzen in unseren RNA-seq-Proben der Roten Milbe zu erkennen. Das Vorhandensein viraler Sequenzen in Bibliotheken von UP (nicht der Wirtsbluternährung ausgesetzt) ​​oder sezierten Mitteldärmen (seziertes inneres Gewebe) zeigte ein echtes D. gallinae-Virom, bestehend aus Red Mite Picorna-like Virus, Red Mite Densovirus, Red Mite Virga-Virus. wie Viren, Rote Vogelmilben-assoziierte Cycloviren, Rote Vogelmilben-assoziierte Hypoviren und Rote Vogelmilben-assoziierte Zystoviren (Abb. 8a). Darüber hinaus wurden mehrere mutmaßliche Transkripte mit signifikanter Homologie zu viralen Proteinen identifiziert, beispielsweise das eines 1,5-kb-Transkripts mit Ähnlichkeit zum Hämagglutinin-Protein (HA) des Wellfleet-Bay-Virus (WFBV, 33,85 % Identität, E-Wert 9e−96) ( Abb. 8a). Bei weiteren tblastN-Suchen, bei denen alle verfügbaren Quaranjavirus-Proteine ​​als Abfragen verwendet wurden, haben wir vier weitere Transkripte entdeckt, die allen typischen Kerngenomsegmenten von Orthomyxoviren ähneln. Dazu gehörte eine Sequenz, die homolog zu einem 1,8-kb-Transkript des Nukleoproteins (NP) des Quaranfil-Quaranjavirus (QRFV, Identität 30,20 %, E-Wert 6e−57) war. Neben diesen Strukturproteinen fanden wir drei Transkripte im Bereich von 2,4 kb bis 2,5 kb mit den besten Treffern für die mehrteiligen RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Untereinheitsproteine ​​PB1 (Tjuloc-Virus, Identität 50 %, E-Wert 0), PB2 (QRFV, Identität 28,90). %, E-Wert 9e−94) und PA (Tjuloc-Virus, Identität 50 %, E-Wert 0). Diese Transkripte wurden unter Verwendung der gefilterten Lesevorgänge jeder Bibliothek poliert und kuratiert, um Konsenssequenzen für jedes Genomsegment zu generieren, unterstützt durch eine mittlere Abdeckung im Bereich von 13,5× bis 47,5×. Die mutmaßlichen Genomsegmente der erwarteten Größe wurden weiter annotiert und präsentierten erwartungsgemäß jeweils einen einzelnen ORF in ihrem komplementären RNA+-Strang, der für die strukturellen und funktionellen Proteine ​​eines typischen Quaranjavirus kodiert, flankiert von nicht translatierten Regionen (Abb. 8b). Die translatierten Polymerase-Untereinheitsproteine ​​PB1, PB2 und PA präsentierten sich mit den konservierten Domänen Flu_PB1 (pfam00602, E-Wert 3,62e−60), Flu_PB2 (5D98_F, E-Wert 8,2e−121) und Flu_PA (4WRT_A, E-Wert 4,9e). −97). Der NP zeigte eine Flu_NP-Domäne (3TJ0_B, E-Wert 7,5e−81) und das mutmaßliche Oberflächen-HA-Protein beherbergte eine typische Baculovirus-gp64-Hüllglycoproteindomäne (Bac_gp64, E-Wert 4,64e−48), ein Signalpeptid (SP). am N-Terminus für die Transmembranpassage und eine C-terminale Domäne. Anschließend untersuchten wir die verschiedenen Bibliotheken von D. gallinae, um das Vorhandensein der Genomsegmente zu beurteilen, die in allen Bibliotheken nach symmetrischen Expressionsmustern auf der Grundlage von FPKMs nachgewiesen wurden und die Möglichkeit stützten, dass die Segmente demselben Virus entsprachen (Abb. 8a). Erwartungsgemäß waren die Expressionswerte der strukturellen Segmente in jeder Bibliothek höher als die der nichtstrukturellen, was ein indirekter Beweis für eine aktive Infektion ist (Abb. 8a). Basierend auf diesen Genomdaten, der genetischen Distanz, der funktionellen und strukturellen Annotation und den Expressionsprofilen schlagen wir vor, dass diese Genomsegmente einem neuen Virus entsprechen; ein mutmaßliches Mitglied einer neuen Art innerhalb der Gattung Quaranjavirus, die wir vorläufig Rote Mite-Quaranjavirus 1 (RMQV1) nannten. Um diese Hypothese zu untermauern, haben wir evolutionäre Erkenntnisse basierend auf der phylogenetischen Analyse der PB1- und NP-Proteine ​​von RMQV1 und verschiedener Orthomyxoviren gewonnen. Der resultierende Baum zeigte deutlich, dass RMQV1 innerhalb der Quaranjavirus-Klade geclustert war (Abb. 8c). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass für D. gallinae ein vielfältiges und komplexes Virom der Roten Vogelmilbe entdeckt und charakterisiert wurde, darunter neuartige Virusarten mehrerer Virusfamilien, die möglicherweise wichtige Auswirkungen auf die Biologie und Gesundheit ihrer Wirte haben. Zukünftige Studien zur Bestimmung der epidemiologischen, ökologischen und veterinärmedizinischen Auswirkungen dieser Viren sind erforderlich.

a Identifizierte virale Segmente und ihre jeweiligen Genhäufigkeiten in Bibliotheken, die aus einzelnen Entwicklungsstadien von D. gallinae stammen. UP-nicht gefütterte Protonymphen, FP-gefütterte Protonymphen, FD-gefütterte Deutonymphen. b Genomdiagramme, die Genomsegmente und vorhergesagte Genprodukte des Rotmilben-Quaranjavirus 1 darstellen. Schwarze Rechtecke zeigen ORFs-kodierende Sequenzen an, graue Rechtecke sagen Proteine ​​voraus und hellgraue Rechtecke zeigen Koordinaten von strukturellen oder funktionellen Domänen an. Abkürzungen werden im Haupttext beschrieben. (Rechtes Feld) Expressionswerte für identifizierte Segmente des Roten Milbenquaranjavirus. c Phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit basierend auf der Ausrichtung der vorhergesagten PB1- und NP-Proteine ​​des Rotmilben-Quaranjavirus 1 (Sternchen) und verwandter Viren. Zweigbezeichnungen repräsentieren FastTree-Unterstützungswerte. Die Maßstabsleiste stellt die Ersetzungen pro Standort dar.

Die Bluternährung hat sich bei Acari62 mehrfach weiterentwickelt. Die blutsaugenden Arthropoden zeigen eine bemerkenswerte Fähigkeit zur schnellen Proteolyse des Wirtsbluts, das eine sehr reichhaltige Proteinquelle ist (90 % Trockengewicht). Es wurde vermutet, dass der hämoglobinolytische Apparat in ihrem Verdauungstrakt von phylogenetisch verwandten blutsaugenden Parasiten gemeinsam genutzt wird, und er wurde als vielversprechender Angriffspunkt gegen Parasiten hervorgehoben63. Obwohl Zecken und Dermanyssoidmilben zur gleichen Ordnung Acarina (Klasse Arachnida) gehören und beide blutsaugende Ektoparasiten darstellen, stützen die hier gewonnenen Daten die Hypothese des unabhängigen Auftretens der Blutsaugung. Dies wird durch ihre deutlichen Unterschiede in der proteolytischen Verdauungsmaschinerie untermauert. Während sowohl harte (I. ricinus) als auch weiche Zecken (Ornithodoros moubata) auf Cathepsin B als wichtigste hämoglobinolytische Peptidase angewiesen sind,64 was auch für Acariforme Milben gilt,65 konnten wir keine für Cathepsin B- oder Cathepsin C-ähnliche Proteasen kodierende Zecken identifizieren Transkripte in Transkriptomen von D. gallinae (Mesostigmata-Milben). Der blutverdauende proteolytische Apparat von D. gallinae-Milben scheint daher hauptsächlich auf sauren lysosomalen Proteasen (Legumain, Cathepsin L und Cathepsin D) zu beruhen, die den Großteil aller Protease-kodierenden Lesevorgänge im erwachsenen D. gallinae-Mitteldarm ausmachen. Dieser Befund bestätigt die frühere Beobachtung und zeigt eine klare Fähigkeit des D. gallinae-Homogenats, Hämoglobin bei saurem pH-Wert zu verdauen, wobei die Aktivität durch E-64 und Pepstatin A gehemmt wird, was auf die Beteiligung von Cystein- und Asparaginproteasen hinweist66. Zeckenverdauliches Cathepsin L (IrCL1) zeigt bekanntermaßen deutliche hämoglobinolytische und albuminolytische Aktivitäten mit einem Peak bei pH 3,5, was auf seine saure Wirkungsweise innerhalb der endolysosomalen Vesikel von Zeckendarmzellen hinweist67. Es ist daher sinnvoll zu spekulieren, dass die Beteiligung von D. gallinae-Cathepsin-L-Proteasen am analogen biologischen Prozess der Proteinverdauung im Blut des Wirts beteiligt sein könnte, möglicherweise auch innerhalb intrazellulärer Säurelysosomen. Darüber hinaus zeigen Transkripte für Cathepsin L5 und Legumain 4 eine deutliche mitteldarmspezifische Hochregulation mit Bluternährung ähnlich wie bei Zecken68, was auf ihre direkte Beteiligung an der Verdauung von Blutproteinen des Wirts hinweist. Eine detaillierte Kartierung der im Mitteldarm von D. gallinae vorhandenen proteolytischen Aktivitäten auf der Grundlage spezifischer Substrate und Inhibitoren bleibt jedoch eine experimentelle Herausforderung für die kommende Forschung auf diesem Gebiet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nach weniger als einer Stunde Fütterung am Wirt69, in der die Milben ihr Körpergewicht um das Zehnfache erhöhten70, eine schnelle Verdauung außerhalb des Wirts erfolgte. Bei der nahe verwandten Dermanyssoidmilbe Ornithonyssus sylviarum wurde etwa die Hälfte des aufgenommenen Erythrozytengehalts innerhalb von 4–8 Stunden71 verdaut. Ähnlich wie Zecken und Acariformes-Milben72 scheinen parasitiforme blutsaugende Milben (D. gallinae)66 das Blut des Wirts intrazellulär zu verdauen, indem sie einen Multienzymkomplex aus hauptsächlich sauren endolysosomalen proteolytischen Enzymen verwenden, ihnen fehlen jedoch jegliche Cathepsin-B- und C-Homologe.

Es ist jetzt klar, dass D. gallinae-Milben für die vollständige Häm-Biosynthese kodieren. Die Heterogenität der Expressionsprofile einzelner Transkripte, die Häm-Biosyntheseenzyme kodieren, lässt jedoch nicht vollständig erkennen, in welchem ​​Entwicklungsstadium der Biosyntheseweg aktiv sein könnte, und zeigt nur sehr wenig ein vom Entwicklungsstadium oder dem Fütterungsstatus abhängiges Expressionsmuster. Es wurde gezeigt, dass das Transkript, das für Ferrochelate, das letzte Enzym der Häm-Biosynthese, kodiert, im Mitteldarm deutlich angereichert ist, ähnlich wie bei teilweise gefütterten Zecken73, was die Frage aufwirft, ob dieses Enzym in diesem Raum und in dieser Zeit benötigt wird, da das Gewebe mit großen Mengen davon überflutet wird Häm. Aufgrund der fehlenden Hämablagerungen in den Eiern von D. gallinae spielt maternal erworbenes Häm wahrscheinlich keine Schlüsselrolle bei der Embryogenese und Fortpflanzung, wie dies bei Zecken der Fall ist22. Dies zeigt sich auch deutlich an der fehlenden Farbe der abgelegten Eier, die geschätzte Häm-b-Gehalte im Subpicomol-Bereich pro mg der eierreichen Probe enthalten; Dies steht in krassem Gegensatz zu etwa einem Nanomol Häm B, das sich in den Eiern von Zecken ablagert22.

Ähnlich wie Zecken74,75 scheint D. gallinae zwei separate Ferritin-Gene zu enthalten, die für zytosolische und sezernierte Ferritine kodieren. Die Expression von Transkripten, die diese beiden Ferritine in D. gallinae kodieren, weist auf ihre Schlüsselrolle bei der Eisenhomöostase im Mitteldarm hin. Wir gehen davon aus, dass Ferritin 1, das das auf Eisen reagierende Element in seiner 5′-UTR besitzt und dem das Signalpeptid fehlt, als intrazelluläres Eisenspeicherprotein fungiert. Im Gegensatz dazu weist das sekretorische Ferritin 2 eine klare N-terminale Signalsequenz auf, was darauf hindeutet, dass es beim Eisenexport aus dem Mitteldarm eine Rolle spielt und somit die somatische Verteilung von im Mitteldarm aufgenommenem Eisen ähnlich wie bei Zecken und Insekten erleichtert75,76. Beide D. gallinae-Ferritine besitzen ein konserviertes Ferroxidase-Di-Eisen-Zentrum (das die schnelle Oxidation von Fe2+ zu Fe3+ erleichtert) sowie ein Ferrihydrit-Keimbildungszentrum (das die Keimbildung und Speicherung von Fe3+ fördert); Diese stellen charakteristische Motive für Ferritine der schweren Kette (H) bzw. der leichten Kette (L) dar. Daher handelt es sich bei D. gallinae-Ferritinen offenbar um Hybride aus H- und L-Typen, ähnlich wie experimentell für das Krustentier-Ferritin77 nachgewiesen und für die Zecken-Ferritine 1 und 278 berichtet wurde. Von anderen durchgeführte RNAi-Studien zeigten, dass beide Ferritine für das Überleben und die Reproduktion von essentiell waren D. gallinae-Milben79. Es wurde auch gezeigt, dass sekretorisches Ferritin (in dieser Studie als Dg-Fer1 bezeichnet) ein wirksames Ziel ist, das Hühnern einen durch Antikörper vermittelten Schutz gegen D. gallinae-Milben verleiht, wenn es als rekombinantes Antigen verwendet wird79. Die Nahrungsquelle für Eisen, das sowohl das zytosolische als auch das sekretorische Ferritin belastet, ist nicht klar. Da bei D. gallinae jedoch keine genetische Kodierung für die Hämoxygenase, ein Enzym, das Eisen aus dem Porphyrinring des Häms freisetzt, vorhanden ist, wird der bioverfügbare Eisenvorrat wahrscheinlich aus Transferrin im Wirtsblut gewonnen, wie experimentell für Zecken festgestellt wurde22,80.

Die Immunerkennungs- und Signalwege Toll und IMD sowie die Immunauslöser wurden hier basierend auf der Anwesenheit/Abwesenheit bekannter Homologe rekonstruiert. Während wir den gesamten Toll-Pfad abbauen konnten, war der Imd-Pfad erheblich eingeschränkt, da Schlüsselkomponenten wie IMD und Relish fehlten. Die in D. gallinae-Milben identifizierten beibehaltenen Mitglieder, die auch in den IMD-Signalweg von Insekten integriert sind, waren Caspase (DREDD, Cystein-abhängige ASPartyl-spezifische ProteASE) und Serin/Threonin-Kinase (TAK1 und IKKβ). Das Fehlen (weder in unserem Transkriptom noch im Genom mit einem Eval-Cut-off = 0,0001 identifiziert) einer kritischen Komponente des Signalwegs, des Transkriptionsfaktors Relish, deutete auf die Nichtfunktionalität des IMD-Signalwegs bei D. gallinae-Milben hin, ähnlich wie bei die phylogenetisch verwandten Milben Varroa (Parasitiformes; Eval-Cut-off < 10e−3) und Metaseiulus (Acariformes)81. Die Untersuchung des D. gallinae-Transkriptoms nach Komponenten des Urkomplementsystems, dargestellt durch Thioester-haltige Proteine, ergab, dass diese Milbe, ähnlich wie andere Chelicerate wie Zecken, Spinnen und sogar der Pfeilschwanzkrebs51,52,82,83, besitzt alle wichtigen TEP-Gruppen, nämlich α2-Makroglobulin, C3-ähnliche Komplementkomponente, TEP vom Insektentyp und Makroglobulin-Komplement-verwandte (MCRs). Einige dieser Gruppen gingen jedoch offenbar im Laufe der Evolution verloren, beispielsweise C3-ähnliche Moleküle aus Krebstieren und Hexapoden oder α2Ms aus einigen Insektenlinien wie Fruchtfliegen oder Mücken51. Das einzelne im D. gallinae-Transkriptom gefundene α2M wird innerhalb der „Köderregion“ durch alternatives Spleißen diversifiziert, vermutlich um das Portfolio der Zielproteasen zu erweitern, die durch den Mechanismus des molekularen Einschlusses inhibiert werden84, wie zuvor für Zecken-α2Ms85,86 berichtet.

Neben der Siliziumdioxid-Bestäubung werden bei der kommerziellen Eiablage auch chemisch synthetisierte Antiparasitika eingesetzt, um Populationen von D. gallinae-Milben zu bekämpfen. Die meisten der kommerziell erfolgreichen Akarizide zielen auf ionengesteuerte Chloridkanäle ab, was zur Einschränkung oder Eliminierung von D. gallinae-Milben in Geflügelställen führt87. Durch Mikroinjektion ausgewählter kommerzieller Akarizide, suspendiert in DMSO und anschließender 100-facher Verdünnung mit sterilem PBS, haben wir das dosisabhängige Überleben von D. gallinae-Milben bewertet. Während wir nach der Mikroinjektion von Fluralaner und Ivermectin eine klare zeit- und dosisabhängige Letalität der Milben feststellen konnten, ähnlich wie in früheren Studien, bei denen ein anderer Verabreichungsweg genutzt wurde87,88, konnten wir die akarizide Wirkung von Fipronil, das durch Mikroinjektion verabreicht wurde, nicht beobachten . Diese Beobachtung steht möglicherweise im Einklang mit der zuvor berichteten geringeren und heterogenen Empfindlichkeit von D. gallinae-Milben gegenüber topischer Exposition gegenüber Fipronil-Lösung89. Während wir keine Kenntnisse über Acari-spezifische Chloridkanäle haben, gibt es immer mehr Arbeiten zu pH-empfindlichen Chloridkanälen bei anderen Wirbellosen. Interessanterweise reagiert der pH-empfindliche Chloridkanal von Bombyx mori empfindlich auf Ivermectin, reagiert jedoch nicht auf Fipronil90, was an unsere Daten aus Lebensfähigkeitstests nach Mikroinjektion von Agonisten erinnert. Dies könnte darauf hindeuten, dass pH-abhängige Chloridkanäle wichtige Ziele für Kanalagonisten wie Ivermectin bei der Auslösung akarizider Aktivität sein könnten.

D. gallinae ist ein globaler und äußerst schädlicher Geflügelschädling. Mit den jüngsten bahnbrechenden Grundlagen17,26,91 für das detaillierte molekulare Verständnis könnten neue akarizide Angriffspunkte, die möglicherweise in blutsaugenden Milben vorkommen, identifiziert und validiert werden. Hier haben wir neue D. gallinae-Transkriptome sequenziert und zusammengestellt und dabei mit Blut gefütterte und nicht gefütterte Milben sowie ganze Körper und mikrosezierte Mitteldärme verglichen. Hierbei handelt es sich um wichtige informative Datensätze, die Einblicke in die molekularen Anpassungen dieses Ektoparasiten an seinen obligatorischen Blutnahrungslebensstil ermöglichen. Es stellt uns außerdem einen Katalog potenzieller Ziele zur Verfügung, die für die zielbasierte Entwicklung von Akariziden geeignet sind. Die Sequenzen der zusammengestellten Contigs, Anmerkungen und jeweiligen Ausdruckswerte sind über eine benutzerfreundliche, einteilige Excel-Tabelle mit Hyperlinks verfügbar (siehe Datenverfügbarkeit). Im Gegensatz zu früheren Studien wird unsere RNA-seq-basierte Arbeit durch Lebensfähigkeitstests ergänzt, die über die künstliche Membranfütterungsplattform, Hämocoel-Mikroinjektion und auch durch massenspektrometrische Metabolitenidentifizierung durchgeführt werden. Schließlich haben wir das D. gallinae-spezifische RNA-Virom identifiziert und möglicherweise besorgniserregende Viren hervorgehoben. Diese Arbeit präsentiert eine integrative Bewertung der zusammengestellten und kuratierten, von Illumina stammenden Daten, beschreibt die molekularen Merkmale, die inhärent mit dem blutsaugenden Lebensstil von D. gallinae verbunden sind, und enthüllt seine aufkommende Rolle als Reservoir neuer Virusvarianten.

Milben wurden durch Bürsten von Käfigen von eierproduzierenden Hühnern im Internationalen Geflügeltest Ustrasice (MTD Ustrasice, Tschechische Republik) gesammelt. Milben wurden mit einem FlyPad (Flystuff.com) kurzzeitig mit CO2 betäubt und in drei Entwicklungsstadien unterteilt: Protonymphen, Deutonymphen und Erwachsene. Protonymphen wurden weiter in ungefütterte und blutgenährte Milben unterteilt. Die Mitteldärme wurden im Erwachsenenstadium mikropräpariert. Die Milben wurden mit der Bauchseite nach unten auf ein Doppelklebeband gelegt, mit einem Rasiermesser enthauptet und die Mitteldärme in einen Tropfen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) herausgezogen. Ganze Milben unterschiedlicher Entwicklungsstadien (jeweils n = 30) wurden mit einem Eppi-Pistill homogenisiert, und Mitteldärme (n = 40) wurden mit einer 29-G-Insulinspritzennadel homogenisiert. Die Gesamt-RNA wurde mit einem NucleoSpin RNA-Kit (Macherey Nagel) aus den Homogenaten extrahiert und in RNase-freies Wasser eluiert, mit einer Ausbeute von 2–7 µg Gesamt-RNA. Ein Agilent 2100 BioAnalyser bewertete die Qualität der RNA mit RIN-Werten ≥ 9. Eine nichtsträngige cDNA-Bibliothek wurde mit dem NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit für Illumina® erstellt und auf NovaSeq600 von Novagene Co., Ltd. mit 150 bp sequenziert Paired-End-Lesevorgänge.

Der Zusammenbau des Transkriptoms und die Extraktion der Kodierungssequenz wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt92. Kurz gesagt, Lesevorgänge wurden von ihren kontaminierenden Primern befreit und Basen mit gleichen Werten < 20 wurden mit dem Programm Trim Galore (Krueger F. Trim Galore: ein Wrapper-Tool rund um Cutadapt und FastQC. Trim Galore. 2012) getrimmt. Saubere Lesevorgänge wurden mit den Assemblern Abyss93 und Trinity94 zusammengestellt. Diese Baugruppen wurden mithilfe einer parallelisierten Pipeline aus Blastn- und Cap3-Assembler95 wie zuvor beschrieben96 zusammengeführt. Wir extrahierten alle offenen Leserahmen, die größer als 200 Nukleotide waren, und diejenigen, die mit bekannten Proteinen übereinstimmten oder ein Signalpeptid aufwiesen, wurden beibehalten. Die resultierenden Peptid- und Kodierungssequenzen wurden in einer mit Hyperlinks versehenen Tabelle abgebildet, einschließlich Blastp- und Rpsblast-Übereinstimmungen mit mehreren Datenbanken sowie einer Angabe des Signalpeptids97, der Transmembrandomänen98 und der O-Galaktosylierungsstellen99. Transkripte, die einem bestimmten Entwicklungsstadium zugeordnet wurden, wurden durch einen 16-fachen Änderungsfaktor gefiltert, d. h. um ein Transkript als „erwachsenenspezifisch“ zu kennzeichnen, lagen seine FPKM-Werte >16-fach über seinen FPKM-Werten im Transkriptom von FP, und zwar gleichzeitig , im Transkriptom gefütterter Deutonymphen (siehe „Datenverfügbarkeit“). Um Transkripte aufzulisten, die im Transkriptom von über UP gefütterten Personen angereichert sind, wurden nur Transkripte mit klaren Annotationen (E-Wert < e−100), Abdeckung > 10 % und FPKM in FP > 5 berücksichtigt. Die Transkripte wurden dann nach dem höchsten Verhältnis von gefütterter/nicht gefütterter Person aufgelistet.

Wir haben wie oben Gesamt-RNA-Proben in 3–5 unabhängigen biologischen Replikaten vorbereitet. Für die RNA-Extraktion wurden 30 Milben (ganze Körper) oder Mitteldärme von vierzig erwachsenen Milben verwendet, was etwa 1 μg RNA pro Extraktion ergab, mit Ausnahme von Proben erwachsener Milben (ganze Körper), die etwa 8 μg RNA pro Extraktion ergaben. Einzelsträngige cDNA wurde aus 0,2 µg Gesamt-RNA unter Verwendung des First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) mit Oligo(dT)18-Primern revers transkribiert. Für RT-qPCR wurde die cDNA 10-fach in nukleasefreiem Wasser mit 10 pmol jedes Primers verdünnt und in einer 10-μL-Reaktion in 384-Well-Platten (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Thermo Fisher Scientific, USA) durchgeführt. , unter Verwendung von FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche Life Sciences), im QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR-System (Thermo Fisher Scientific, USA). Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in den Ergänzungstabellen S3, S4 und S7 aufgeführt.

Der für die phylogenetische Analyse von Arthropoden-Vitellogeninen verwendete Datensatz bestand aus 67 Aminosäuresequenzen, die Homologe von Zecken, Milben, Milben, Spinnen, Skorpionen, Pfeilschwanzkrebsen, Insekten und Krebstieren darstellten, wobei letztere eine Außengruppe darstellten (Ergänzungstabelle S8). Die Vitellogenin-Sequenzen wurden als mit GenBank-Annotationen versehene Einträge abgerufen oder aus den in GenBank verfügbaren Genom-/Transkriptom-Assemblys mithilfe des tBlastN-Algorithmus und eines E-Wert-Grenzwerts < 10–5 ermittelt. Die strukturell ähnlichen Häm-Lipo-Glykoproteine ​​von Zecken (z. B. GenBank: ABK40086 und ACF35055) und ihre zugehörigen Zeckensequenzen, die in GenBank als Vitellogenine annotiert sind (z. B. GenBank: AXP34688, BAJ21514, AXP34687, XP_029826448), wurden nicht in die Analyse einbezogen, da diese Proteine ​​sind keine echten Vitellogenin-Homologen. Vitellogenin-Sequenzen wurden in MAFFT (Version 7.017)100, implementiert in Geneious Prime v2019.0.4101, unter Verwendung einer automatischen Auswahl der Ausrichtungsstrategie und Standardparametern für die Lückenöffnungsstrafe (1,53) und den Offsetwert (0,123) ausgerichtet. Wir haben nicht homologe Regionen des Alignments gekürzt, indem wir GBlocks v0.91b102 mit Standardparametern verwendet haben, mit der Ausnahme, dass die minimale Blocklänge auf 5 eingestellt war und die Hälfte der Lückenpositionen zulässig waren, sodass das endgültige Alignment 3578 Aminosäurepositionen umfasste, die die drei typischen Strukturdomänen umfassten Vitellogenine (d. h. die N-terminale Region von Vitellogenin, die Domäne unbekannter Funktion [DUF1943] und die Domäne des Von-Willebrand-Faktors Typ D). Der phylogenetische Baum wurde mit der Maximum-Likelihood-Methode (ML) in IQ-TREE v1.6.12103 unter Verwendung des von ModelFinder104 ausgewählten LG + F + R6-Proteinmodells rekonstruiert. Bootstraps basierten auf 1000 Replikaten. Die Bayes'sche Inferenzanalyse (BI) wurde in MrBayes v3.2.7a105 durchgeführt, implementiert in CIPRES Science Gateway v3.3106, wobei vier gleichzeitige MCMC-Ketten verwendet wurden, die in Abständen von 100 Bäumen abgetastet wurden, und A-Posteriori-Wahrscheinlichkeiten aus 2 Millionen Generationen geschätzt wurden. Das Evolutionsmodell WAG + F + G4 wurde von ModelFinder ausgewählt. Die Einbrennphase machte 10 % aller Generationen aus. Der Baum wurde in Geneious Prime v2019.0.4 visualisiert und in Adobe Illustrator CS5 grafisch modifiziert.

Für die phylogenetische Analyse der Cys-Loop-Ligand-gesteuerten Ionenkanal-Genfamilie verwendeten wir einen Datensatz bestehend aus 121 Aminosäuresequenzen, die dem Datensatz von Dermauw et al.40 entsprachen und um die Homologen von D. gallinae angereichert waren (Supplementary Daten S1). Die aus den mit GenBank-Annotationen versehenen Einträgen abgerufenen Sequenzen wurden abgeglichen und wie oben für den Vitellogenin-Datensatz beschrieben behandelt. Das endgültige Alignment umfasste 502 Aminosäurepositionen. Der ML-basierte phylogenetische Baum und seine Knotenträger wurden unter Verwendung des LG + I + G4-Proteinmodells berechnet, wie für die Vitellogenine beschrieben.

Für die phylogenetische Analyse der Familie der thioesterhaltigen Proteine ​​(TEP) enthielt der Datensatz 29 Aminosäuresequenzen von D. gallinae-TEPs und seinen wirbellosen Homologen aus der Fruchtfliege D. melanogaster, der harten Zecke I. ricinus und dem Pfeilschwanzkrebs L. polyphemus (Ergänzende Abbildung S8). Die Sequenzen wurden abgeglichen und behandelt, wie oben für den Vitellogenin-Datensatz beschrieben. Das endgültige Alignment der vollständigen Aminosäuresequenzen (~1500 Reste) umfasste 2737 Aminosäurepositionen. Der ML-basierte phylogenetische Baum und seine Knotenträger wurden unter Verwendung des BLOSUM62 + G-Proteinmodells berechnet, wie für die Vitellogenine beschrieben.

Zur metabolomischen Analyse wurden in einem Geflügelstall durch Bürsten gesammelte Milben in einer 1-L-Flasche mit Papierdeckel bei 21 °C im Dunkeln gelagert. Am nächsten Tag wurde eine Mischung aus Eiern, Larven und UP wie oben beschrieben aussortiert. Dann wurde die Probe der nicht gefütterten Stadien (um den Nachweis von Häm-Zwischenprodukten des Wirts zu verhindern) mit einem überwiegenden Anteil an UP aus 21,4 mg Milben mit 150 µL eines kalten Extraktionsmediums, MeOH:ACN:H2O (2:2: 1 v/v/v), enthält einen internen Standard, 4-Fluorphenylalanin (100 µL mit 0,5 ng/µL). Anschließend wurde die Probe mit einem Tissue Lyser II (Qiagen, Prag, Tschechische Republik) bei 50 Hz und 0 °C 5 Minuten lang homogenisiert. Die Mischung wurde dann 10 Minuten lang bei 7000 U/min und 5 °C zentrifugiert, und der Überstand wurde 10 Minuten lang bei 8000 U/min und 5 °C durch einen 0,2 μm PVDF-Mini-Spin-Filter (HPST, Prag, Tschechische Republik) filtriert. Schließlich wurde ein 50-µL-Aliquot des Überstands für die flüssigkeitschromatographisch-hochauflösende massenspektrometrische Analyse (LC-HRMS) verwendet. Die LC-HRMS-Methoden wurden bereits früher ausführlich beschrieben107,108. Kurz gesagt: Das AQ Exactive Plus Orbitrap-Massenspektrometer in Verbindung mit einem Dionex Ultimate 3000-Flüssigkeitschromatographen (alle Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) wurde zur Profilierung von Zwischenprodukten der Häm-Biosynthese verwendet. Metaboliten wurden auf einem SeQuant ZIC-pHILIC (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) mit 150 mm × 4,6 mm Innendurchmesser und 5 μm mit einer Flussrate der mobilen Phase von 450 μl/min, einem Injektionsvolumen von 5 μl und einer Säulentemperatur getrennt von 35 °C. Die mobile Phase war: A = Acetonitril, B = 20 mmol/L wässriges Ammoniumcarbonat (pH = 9,2; eingestellt mit NH4OH); Steigung: 0 Min., 20 % B; 20 Min., 80 % B; 20,1 Min., 95 % B; 23,3 Min., 95 % B; 23,4 Min., 20 % B; 30,0 Min. 20 % B. Die Q-Exactive-Einstellungen waren: Massenbereich 70–1000 Dalton; 70.000 Auflösung (m/z 200; 3 × 106 Automatic Gain Control (AGC) Ziel und maximale Ioneninjektionszeit (IT) 100 ms; Elektrospray im positiven Modus betrieben: 3000 kV Sprühspannung, 350 °C Kapillartemperatur, Mantelgas bei 60 au, Hilfsgas bei 20 au, Ersatzgas bei 1 au, Sondentemperatur 350 °C und S-Lens-Pegel bei 60 au. Die Daten wurden mit der XcaliburTM-Software, Version 4.0 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) verarbeitet. In der Studie verwendete Verbindungen: Deionisiertes Wasser wurde mit einem Direct Q 3UV-Reinigungssystem (Merck, Prag, Tschechische Republik) hergestellt. Methanol und Acetonitril (OptimaTM-Qualität) wurden von Fisher Scientific (Pardubice, Tschechische Republik) gekauft; Ammoniumcarbonat, 25 % Ammoniaklösung, 4-Fluorphenylalanin, 5-Aminolävulinat, Hämin, Porphobilinogen und Protoporphyrin IX von Merck (Prag, Tschechische Republik). Die Menge an Häm b wurde basierend auf der Peakfläche des Standards geschätzt.

Die Milben wurden wie oben beschrieben gesammelt und gelagert. Nach 14 Tagen wurden vitale Individuen ausgewählt und für Ex-vivo-Fütterungsexperimente verwendet. Die Zufuhreinheit war ein Kunststoffzylinder (17 mm Durchmesser, 70 mm Länge), der horizontal durch eine Membran (silikonimprägnierte Goldschlägerhaut) in zwei gleiche Kammern unterteilt war. Die obere Kammer enthielt 2 ml frisches, defibriniertes (durch Mischen mit 4-mm-Glasperlen) Hühnerblut, ergänzt mit dem Inhibitor Torin2 (Sigma-Aldrich, Katalognummer SML1224). Die untere Kammer des Membranfütterungsgeräts enthielt die Milben. Die Fütterungseinheit wurde im Dunkeln in einen auf 41 °C eingestellten Inkubator gestellt. Nach 5 Stunden wurden die gefütterten Individuen gesammelt und in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (jeweils 10 Individuen) in einem auf 21 °C eingestellten Inkubator gelagert. Die Lebensfähigkeit und Vitalität der Milben wurden 7 Tage lang alle 24 Stunden überwacht. Torin2 wurde in DMSO gelöst und weiter auf Endkonzentrationen verdünnt: 500, 250, 100, 10 und 1 µM. DMSO-Vorräte wurden in der Blutmahlzeit auf 1 % v/v DMSO in den Blutmahlzeiten verdünnt.

Die Milben wurden wie oben beschrieben gesammelt und die frisch gefütterten erwachsenen Weibchen wurden aussortiert. Milben wurden auf einem Klebeband immobilisiert und ein Volumen von 13,8 nL der getesteten Verbindung (≤ 1 % v/v DMSO) wurde in das Hämocoel der Milbe mikroinjiziert (Drummond, USA). Nach 10 Minuten wurden injizierte Milben in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt (5 Individuen in 5 Eppi-Röhrchen oder 8 Individuen in 3 Eppi-Röhrchen für jede Konzentration) und im Inkubator bei 21 °C gelagert. Die Lebensfähigkeit und Vitalität der Milben wurden 7 Tage lang alle 24 Stunden überwacht. In der Studie verwendete Verbindungen: Fipronil (Sigma-Aldrich Supelco, Katalognummer 16785), Fluralaner (Cayman Chemical, Artikelnummer 22061), Ivermectin (Sigma-Aldrich, Katalognummer I8898).

Die Entdeckung, Erkennung und Charakterisierung von Viren wurde wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt109. Kurz gesagt, wir haben in dieser Arbeit generierte Transkriptomassemblys als Eingabe für die Virenerkennung verwendet. Die vollständige NR-Freisetzung viraler Proteinsequenzen wurde von https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=txid10239[Organism:exp] abgerufen. Die integrierte RNA-Anordnung der Roten Vogelmilbe wurde durch mehrere tBlastN-Suchen (maximaler E-Wert = 1 × 10−5) bewertet, wobei als Sonde die vollständig vorhergesagten nicht-redundanten Virusproteine ​​auf einem lokalen Server verwendet wurden. Signifikante Homologien wurden manuell überprüft und redundante Contigs wurden verworfen. Potenzielle virusähnliche Sequenzen wurden durch iterative Kartierung von Lesevorgängen mit Bowtie 2 v2.4.4110 kuratiert. Offene Leserahmen (ORF) wurden von ORFfinder vorhergesagt. Die vorhergesagten Proteine ​​wurden BlastP-Suchen bei NCBI und domänenbasierten Blast-Suchen anhand der Conserved Domain Database (CDD) v3.19 unterzogen, die in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml implementiert ist und ergänzt mit SMART http://smart.embl-heidelberg.de/, Pfam http://pfam.xfam.org/, PROSITE http://prosite.expasy.org/ und HHPred https://toolkit.tuebingen. mpg.de/tools/hhpred zur Charakterisierung divergenterer Funktionsdomänen. Signal- und Membranpeptide wurden mit SignalP v4.1111 bewertet. Die viralen RNA-Spiegel wurden mit Cufflinks http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/ oder alternativ mit der Geneious Suite 8.1.9 (Biomatters Inc.) als Fragmente pro Kilobase Virustranskript pro Million zugeordneter Lesevorgänge (FPKM) berechnet ). Evolutionäre Erkenntnisse wurden durch MAFTT (Version 7.310) gelöst. 100 Alignments von Aminosäuresequenzen der vorhergesagten viralen Polymerasen oder Kapsidproteine, die für phylogenetische Analysen auf der Grundlage von FastTree-Phylogenetikbäumen mit ungefährer Maximum-Likelihood verwendet wurden http://www.microbesonline.org/ fasttree/ mit Standardparametern. Die Unterstützung für einzelne Knoten wurde mithilfe eines Approximations-Likelihood-Ratio-Tests mit dem Shimodaira-Hasegawa-ähnlichen Verfahren bewertet. Baumtopologie, Unterstützungswerte und Ersetzungen pro Standort basierten auf 1000 Baum-Resamples. Die meisten Ergebnisse der Sequenzanalyse wurden mit der Geneious Suite 8.1.9 (Biomatters Inc.) integriert und visualisiert. Virusgenomdiagramme wurden mit Adobe Photoshop C3 Version 10 erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten sind als BioProject PRJNA597301 verfügbar, einschließlich NT- und AA-Fasta-Dateien, und eine verlinkte Excel-Tabelle steht zum Download unter https://proj-bip-prod-publicread.s3.amazonaws.com/transcriptome/Dermanyssus_gallinae/Derm_gallinae.zip zur Verfügung . Virussequenzen wurden beim NCBI mit den folgenden GenBank-Zugangsnummern hinterlegt:

RMACTV1-L,ON160022;RMACTV1-S,ON160023;RMQV1-HA,ON160024;RMQV1-NP,ON160025; RMQV1-PA,ON160026;RMQV1-PB1,ON160027;RMQV1-PB2,ON160028;RMDIV1,ON160029; RMIV1, ON160030;RMDEV1,ON160031;RMVLV1,ON160032;RMVLV2,ON160033;RMACYV1,ON160034;RMAHV1,ON160035.

Die zur Generierung von Abb. 4b verwendeten Rohdaten wurden im Figshare-Repository mit den folgenden DOIs hinterlegt: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22658317.v1, https://doi.org/10.6084/m9.figshare .22658338.v1, https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22658386.v1, https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22658458.v1.

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Diese Arbeit wurde hauptsächlich durch das ZETA-Programm der Technologieagentur der Tschechischen Republik, Zuschuss Nr. TJ02000107 an JP, und zusätzlich durch die Zuschüsse Nr. 22-18424M an JP, 20-05736S und 21-08826S an PK der Tschechischen Wissenschaftsstiftung unterstützt. und vom „Zentrum für die Erforschung der Pathogenität und Virulenz von Parasiten“ (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759), finanziert vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) und dem Ministerium für Bildung, Jugend und Sport (MEYS). JMCR wurde vom Intramural Research Program des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (Vector-Borne Diseases: Biology of Vector Host Relationship, Z01 AI000810-20) unterstützt. Diese Arbeit nutzte die Rechenressourcen des NIH HPC Biowulf-Clusters (http://hpc.nih.gov). Wir danken Dr. Martina Hajduskova (www.biographix.cz) für die grafische Visualisierung. Auch für die konstruktive Kritik der Manuskriptgutachter sind wir dankbar.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: José M. Ribeiro, David Hartmann.

Labor für Malaria- und Vektorforschung, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, MD, USA

José M. Ribeiro

Institut für Parasitologie, Biologiezentrum, Tschechische Akademie der Wissenschaften, 37005, České Budějovice, Tschechische Republik

David Hartmann, Pavla Bartošová-Sojková, Martin Palus, Matěj Kučera, Ondřej Hajdušek, Daniel Sojka, Petr Kopáček und Jan Perner

Institut für Pflanzenpathologie, Agrarforschungszentrum, Nationales Institut für Agrartechnologie (IPAVE-CIAP-INTA), Córdoba, Argentinien

Humberto-Debatte

Institut für Entomologie, Biologiezentrum, Tschechische Akademie der Wissenschaften, 37005, České Budějovice, Tschechische Republik

Martin Moos & Petr Simek

Internationale Geflügelteststation Ústrašice, Ústrašice, Tschechische Republik

Jiří Fara

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Konzeptualisierung (DH, PK, JP), Methodik (JMR, DH, PBS, HD, MM, P.Š, JF, MP, MK), Validierung (DH, PBS, MM), Formale Analyse (JMR, DH, PBS , HD, MM, OH, DS, PK, JP), Untersuchung (JMR, DH), Ressourcen (JMR, HD), Datenkuration (JMR, HD), Schreiben – Originalentwurf (JP), Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung ( JMR, DH, PBS, HD, MM, P.Š., OH, DS, PK, JP), Visualisierung (JMR, DH, PBS, HD, MM, OH, DS, PK, JP), Projektverwaltung (JP) , Finanzierungsakquise (JMR, PK, JP).

Korrespondenz mit Jan Perner.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Ben Mans, Han Xia und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Luke R. Grinham.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ribeiro, JM, Hartmann, D, Bartosová-Sojková, P et al. Bluternährungsanpassungen und Virombewertung der roten Vogelmilbe Dermanyssus gallinae anhand von RNA-seq. Commun Biol 6, 517 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04907-x

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Eingegangen: 20. Mai 2022

Angenommen: 03. Mai 2023

Veröffentlicht: 13. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04907-x

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