Molekulare Charakterisierung und Immunwirksamkeit von Fructose

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 169 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Zecken sind obligat hämatophage Ektoparasiten, die eine Vielzahl von Krankheitserregern auf Menschen, Wildtiere und Haustiere übertragen. Die Impfung ist eine wirksame und umweltfreundliche Methode zur Zeckenbekämpfung. Fruktose-1,6-bisphosphat-Aldolase (FBA) ist ein wichtiges Glykometabolismus-Enzym, das als Impfstoffkandidat gegen Parasiten in Frage kommt. Der Immunschutz von FBA bei Zecken ist jedoch unklar.

Der 1092 bp große offene Leserahmen (ORF) von FBA aus Haemaphysalis longicornis (HlFBA), der ein 363 Aminosäuren langes Protein kodiert, wurde mithilfe der PCR-Methode kloniert. Der prokaryotische Expressionsvektor pET32a(+)-HlFBA wurde konstruiert und zur Proteinexpression in Zellen des Escherichia coli BL21(DE3)-Stamms transformiert. Das rekombinante HlFBA-Protein (rHlFBA) wurde durch Affinitätschromatographie gereinigt und die Western-Blot-Ergebnisse ließen darauf schließen, dass das rHlFBA-Protein immunogen war.

Die Ergebnisse des enzymgebundenen Immunosorbens-Assays zeigten, dass mit rHlFBA immunisierte Kaninchen eine humorale Immunantwort erzeugten, die spezifisch für rHlFBA war. Ein Versuch zum Zeckenbefall zeigte, dass im Vergleich zu den Zecken in der Histidin-markierten Thioredoxin (Trx)-Gruppe das Gewicht der Zecken und die Eiablage weiblicher Zecken sowie die Eischlüpfrate der Zecken in der rHlFBA-Gruppe um 22,6 % bzw. 45,6 % reduziert waren 24,1 % bzw. Basierend auf der kumulativen Wirkung dieser drei Parameter wurde die gesamte Immunwirksamkeit von rHlFBA auf 68,4 % geschätzt.

FBA ist ein Impfstoffkandidat gegen Zecken, der das Gewicht der angeschwollenen Zecken, die Eiablage und die Brutrate der Eier deutlich reduzieren kann. Der Einsatz von Enzymen, die am Glukosestoffwechsel beteiligt sind, ist eine neue Strategie bei der Entwicklung von Anti-Zecken-Impfstoffen.

Zecken, die obligatorisch blutsaugende Arthropoden sind, sind weltweit die wichtigsten Krankheitsüberträger bei Menschen und Tieren [1]. Sowohl Zecken als auch die von ihnen übertragenen Mikroben stellen eine erhebliche Bedrohung für die Gesundheit von Mensch und Tier dar [2]. Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae) ist eine in Ostasien heimische Zeckenart und hat sich in Australien, Neuseeland und mehreren pazifischen Inseln etabliert [3]. Es überträgt Krankheitserreger wie Theileria uilenbergi, Babesia motasi, Rickettsia hebeiii und Anaplasma phagocytophilum [4,5,6,7]. Es ist auch der Überträger von schwerem Fieber mit dem Thrombozytopenie-Syndrom-Virus (SFTSV), das die Gesundheit von Mensch und Tier gefährdet [8]. Daher ist die Entwicklung eines Anti-H. Longicornis-Impfstoff [9, 10].

Galay et al. untersuchten zwei Arten des eisenbindenden Proteins Ferritine aus H. longicornis (HlFER), ein intrazelluläres HlFER1 und ein sekretorisches HlFER2, als Anti-Zecken-Impfstoffe [11]. Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass Antikörper mit dem rekombinanten HlFER (rHlFER) kreuzreagierten und auch mit nativen HlFERs reagierten. Ein Zecken-Challenge-Experiment zeigte, dass Zecken, die mit dem mit rHlFER2 inokulierten Kaninchen gefüttert wurden, ein geringeres Anschwellungsgewicht aufwiesen als Zecken in der Kontrollgruppe. Die Eiablage und die Schlupffähigkeit waren in beiden mit rHlFER inokulierten Gruppen verringert. Die Impfstoffwirksamkeit von rHlFER1 und rHlFER2 betrug 34 % bzw. 49 % [11]. In einer anderen Studie wurde der offene Leserahmen (ORF) von H. longicornis-Subolesin (HlSu) identifiziert und das rekombinante HlSu (rHlSu) in Escherichia coli exprimiert [12]. Mit rHlSu immunisierte Kaninchen erzeugten eine Immunantwort. In der rHlSu-immunisierten Gruppe waren das Anschwellungsgewicht und die Eiablage der weiblichen Zecken deutlich geringer als in der Kontrollgruppe. Die berechnete Wirksamkeit des Impfstoffs wurde auf 37,4 % geschätzt [12]. In einer nachfolgenden Studie stellten Wang et al. klonierte das Lipocalin-Homologgen (HlLIP) von H. longicornis in pET-32(a+), um das rekombinante Protein (rHlLIP) zu erhalten; Die Immunogenität von RHlLIP wurde durch Western Blot bestätigt [13]. Ein Immunisierungsversuch an Kaninchen, die mit H. longicornis infiziert waren, zeigte, dass Antikörper gegen das rHlLIP-Protein das Anschwellungsgewicht, die Eiablage und die Schlupfwahrscheinlichkeit verringerten (die Wirksamkeit des rHlLIP-Proteins betrug 60,17 %). Allerdings ist bis heute ein kommerzieller Anti-H. Da derzeit kein Impfstoff gegen H. longicornis verfügbar ist, ist es wichtig, nach einem wirksamen Schutzantigen gegen einen H. longicornis-Befall zu suchen.

Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase (FBA) ist ein Enzym, das Fructose-1,6-bisphosphat zu Glycerinaldehyd-3-phosphat und Dihydroxyacetonphosphat oder die umgekehrte Aldolalkohol-Kondensationsreaktion katalysiert [14]. FBA, das bei vielen Infektionskrankheiten Immunreaktionen auslösen kann [15], kann auch als Breitbandimpfstoff gegen viele Krankheitserreger eingesetzt werden [16,17,18,19,20]. In einer Studie erlangten Mäuse, die mit rekombinantem FBA (rFBA) + Freunds Adjuvans geimpft wurden, einen Immunschutz gegen Streptococcus pneumoniae-Exposition [21]. Im Vergleich zu Freunds Adjuvans allein erhöhte das rFBA + Freunds Adjuvans die Proliferation von Gedächtnis-CD4+-T-Zellen bei Mäusen und erhöhte die Überlebensraten deutlich. Mäuse-Anti-rFBA-Seren schützten die Mäuse im Vergleich zu Präimmunseren auch signifikant vor einer tödlichen S. pneumoniae-Exposition [21]. Diese Daten legen nahe, dass rFBA ein Impfstoffkandidat zum Schutz gegen S. pneumoniae ist. McCarthy et al. bestätigten, dass Onchocerca volvulus FBA (OvFBA) immunogen ist. Als das rekombinante OvFBA bei Mäusen auf seine Schutzwirkung getestet wurde, verringerte sich die Überlebensrate der Larven um 50 % [16]. Diese Daten unterstützen die weitere Untersuchung dieses Enzyms als Impfstoffkandidat in Tiermodellen.

In der vorliegenden Studie haben wir den ORF von FBA aus H. longicornis (HlFBA) geklont und E. coli verwendet, um das rekombinante HlFBA-Protein (rHlFBA) zu exprimieren. Anschließend analysierten wir die Wirksamkeit des Immunschutzes durch Immunisierung von Kaninchen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass H1FBA ein nützlicher Impfstoff gegen eine H. longicornis-Infektion sein könnte.

Erwachsene Zecken von H. longicornis wurden im Mai von Schafen des Xiaowutai National Natural Reserve Area der Provinz Hebei gesammelt und wie zuvor beschrieben an das Labor geschickt (22). Während der nichtparasitären Phase wurden die Zecken in einem Inkubator gehalten; Während der Parasitenphase wurden Zecken an den Ohren weißer Neuseeland-Kaninchen gefüttert. Für die Experimente wurde die nächste Generation erwachsener Zecken in verschiedenen Entwicklungsstadien gesammelt. Alle Tierversuche wurden gemäß den genehmigten Protokollen der Tierethikkommission der Hebei Normal University (#2021LLSC035) durchgeführt.

Die Gesamt-RNA von erwachsenen H. longicornis-Weibchen wurde mit dem Reagenz TRIzol (TransGen, Peking, China) für die weitere Synthese komplementärer DNA (cDNA) wie zuvor beschrieben extrahiert (23). Der ORF des H1FBA-Gens (HlFBA) wurde unter Verwendung der Primer 5'-ATGGCTGGCCACTTCAC-3' und 5'-TCAGTACTCGTGGTTTTTGATA-3' amplifiziert und kloniert. HlFBA wurde durch PCR-Zyklus erhalten, der aus den folgenden Schritten bestand: Vordegeneration bei 94 °C für 3 Minuten; 30 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 30 s, Annealing bei 60 °C für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 60 s; eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 10 Minuten. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, gefolgt von der Gewinnung und Ligation der Zielbanden in einen pEASY-T1-Vektor, der anschließend zur Sequenzierung in TRANS-T1-Zellen (TransGen) transformiert wurde. Die korrekte Gensequenz wurde in die Aminosäuresequenz übersetzt, gefolgt von einem Mehrfachsequenz-Alignment unter Verwendung von DNAMAN 8.0 (Lynnon Biosoft, Quebec, ONT, Kanada).

Die Transkriptionsprofile von HlFBA aus verschiedenen Entwicklungsstadien (Ei, Larve, Nymphe und Erwachsener) und verschiedenen Organen (Speicheldrüsen, Mitteldarm, Eierstock und Malpighiantubuli) weiblicher Zecken wurden durch quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) geschätzt. Spezifische Primer von HlFBA wurden entworfen (Vorwärtsprimer: 5'-TCTGACCAAGAGGTGCGT-3′; Rückwärtsprimer: 5′-GTAGCGAGCGAGGAC-ATT-3′). Die relative Expression des H. longicornis-β-Actin-Gens (AN AY254898) wurde verwendet, um die HlFBA-Expressionsdaten zu normalisieren [24]. Die Genexpressionsdaten wurden mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet [25]. Alle Analysen wurden mit drei technischen und drei biologischen Replikaten durchgeführt.

Die Primer, die EcoRI- und HindIII-Restriktionsstellen enthielten (Vorwärtsprimer: 5'-GAATTCATGGCTGGCCACTTCAC-3 '; Rückwärtsprimer: 5'-AAGCTTTCAG-TACTCGTGGTTTTTGATA-3'), wurden zur Amplifikation von HlFBA durch PCR verwendet. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-Elektrophorese getrennt und das Zielgen wurde mithilfe eines DNA-Gel-Wiederherstellungskits (BioTeke Corp., Peking, China) gewonnen und in das prokaryotische Expressionsplasmid pET-32a(+) (TransGen) mit der Bezeichnung pET- eingefügt. 32a(+)-HlFBA. Zur Expression von rHlFBA wurden Plasmide in Zellen des E. coli-Stammes BL21 (DE3) (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) transformiert und die Zellen in 10 ml Luria-Bertani (LB)-Brühe mit 10 μg/ml Ampicillin vermehrt ( TransGen) über Nacht bei 37 °C und 200 U/min inkubiert und anschließend zum Animpfen von 100-ml-Kulturen verwendet. Das rHlFBA-Protein wurde durch 0,5 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) bei 25 °C induziert und die Überstände der Zellkulturen wurden durch Elution entlang eines Imidazolgradienten (20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM und 500 mM) in Ni. Sepharose 6 Fast Flow Chromatographieharz (GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Das rHlFBA-Protein wurde mit der Bradford-Methode quantifiziert [26]. Das durch das Plasmid pET-32(a+) exprimierte Histidin-markierte Thioredoxin (Trx)-Protein wurde unter Verwendung des obigen Verfahrens gereinigt.

Zehn nicht gefütterte weibliche Zecken wurden in flüssigem Stickstoff gemahlen und in ein Röhrchen mit 1 ml 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) überführt. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 13.000 U/min und 4 °C wurden einem Kaninchen 500 μg Zeckenprotein, gemischt mit Freunds komplettem Adjuvans, injiziert. Es folgten zwei Injektionen von 500 µg Zeckenprotein gemischt mit Freundschem unvollständigem Adjuvans im Abstand von 2 Wochen. Die Seren wurden am Tag 14 nach der letzten Immunisierung gesammelt und durch die Caprylsäure-Ammoniumsulfat-Fällungsmethode gereinigt, um Kaninchen-Anti-H zu erhalten. Longicornis-Serum.

Eine 20-μg-Probe des Gesamtproteins, einschließlich vorgefärbtem Proteinmarker (TransGen), gereinigtem rHlFBA und IPTG-induziertem E. coli, das pET-32a(+)-HlFBA enthält, wurde auf eine 12 %ige Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS) geladen -PAGE)-Gele, mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt und auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Nach 3-stündiger Blockierung in TBS-Tween-20 (TBST), das 5 % fettfreie Milch enthielt, bei 25 °C wurde die Membran mit 1:2000 verdünntem Kaninchen-Anti-H inkubiert. Longicornis-Serum bzw. Kaninchen-negatives Serum über Nacht. Die Membranen wurden dann mit TBST gewaschen und mit 1:2000 verdünntem Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G (IgG; Proteintech, Chicago, IL, USA) 2 Stunden lang inkubiert. Positive Signale wurden mit SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) erkannt und durch ein Chemilumineszenz-Bildgebungssystem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) fotografiert.

Die Kaninchen wurden zufällig in die PBS-Gruppe, die Trx-Gruppe und die rHlFBA-Gruppe eingeteilt (6 Kaninchen pro Gruppe). In der Versuchsgruppe wurden am Tag 0 0,5 ml rHlFBA (1 μg/μl), gemischt mit 0,5 ml komplettem Freund-Adjuvans, in den Rücken von Kaninchen injiziert, und die gleiche Dosis rHlFBA, gemischt mit unvollständigem Freund-Adjuvans, wurde in den Rücken von Kaninchen injiziert am 14. bzw. 28. Tag. In der Kontrollgruppe wurden 0,5 ml PBS oder Trx-Protein (1 μg/μl), gemischt mit Adjuvans, nach dem gleichen Protokoll in den Rücken von Kaninchen injiziert.

Vor der ersten Immunisierung und an den Tagen 7, 14, 21, 28 und 35 nach der ersten Immunisierung wurde Blut aus den Ohren von Kaninchen zur Analyse des Antikörperspiegels und zur Bestimmung der Werte der optischen Dichte (OD) entnommen; Die Messungen wurden mit der gleichen Verdünnung durchgeführt, was den Antikörperspiegel widerspiegelte [27]. Die rHlFBA-Proteine (1 μg/Vertiefung) wurden verwendet, um ELISA-Platten (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) über Nacht bei 4 °C zu beschichten. Anschließend wurden die Platten 1 Stunde lang bei 37 °C mit Rinderserumalbumin blockiert. Die Platten wurden dann 1 Stunde lang bei 37 °C mit den Seren immunisierter Kaninchen inkubiert, die seriell von 1:200 bis 1:204.800 verdünnt worden waren, und anschließend mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:10.000). 1 h bei 37 °C. Abschließend wurde 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin als Farbsubstratlösung zu den Platten gegeben und die Reaktion durch Zugabe von Schwefelsäurelösung beendet. Die Absorption bei OD450 wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, Silicon Valley, CA, USA) gemessen.

Am 10. Tag nach der dritten Immunisierung der Kaninchen (3 Gruppen, 6 Kaninchen pro Gruppe) wurden 46 erwachsene Zecken (23 weibliche und 23 männliche) in Stoffbeutel freigesetzt, die auf ein Ohr des Kaninchens geklebt waren. Die gleiche Behandlung wurde am anderen Ohr des Kaninchens durchgeführt. Anschließend, nach der Ablösung der weiblichen Zecken vom Wirt, wurden die Anzahl der beißenden Zecken, das Gewicht der Zecken, die Eiablage und die Brutrate der Eier erfasst. Die Wirksamkeit des Impfstoffs (E) wurde zu 100 × [1–(EW × EO × EH)] berechnet, wobei EW, EO und EH das Gewicht der Zecken, die Eiablage und die Eischlüpfrate der Versuchsgruppen bzw. Kontrollgruppe darstellen [11]. ].

Statistische Analysen wurden mit der Software SPSS Version 17.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) durchgeführt. Alle in Abbildungen und Tabellen dargestellten Daten wurden auf Normalität überprüft. Die Antikörperspiegel im Blut, das von den verschiedenen Gruppen zum gleichen Zeitpunkt gesammelt wurde, wurden mittels ELISA analysiert, um die Unterschiede zwischen der Versuchsgruppe und der Kontrollgruppe mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) zu bestimmen. Die Expression von HlFBA in der qRT-PCR-Analyse und die verschiedenen Parameter (Anschwellgewicht, Eiablage und Schlupfbarkeit) im Zeckenbefallsversuch wurden durch eine einfache ANOVA gefolgt vom Tukey-Test analysiert, um die Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungen zu bestimmen. Das Signifikanzniveau wurde auf P < 0,05 festgelegt.

Die Länge des ORF von HlFBA in H. longicornis betrug 1092 bp (KX839690.1) und kodierte 363 Aminosäuren (aa). Mehrere Alignment-Ergebnisse zeigten, dass das HlFBA-Protein (ASV64058.1) 95 %, 91 %, 90 % und 89 % Ähnlichkeit mit FBA aus Dermacentor silvarum (XP_037566647.1), Ixodes scapularis (XP_029847818.1) und Amblyomma variegatum (DAA34561) aufwies. 1) bzw. Rhipicephalus microplus (XP_037283106.1). Das HlFBA-Protein hatte 77–81 % konservierte Aminosäuren im Vergleich zu den FBAs anderer Spinnentiere wie Araneus ventricosus (GBN85837.1), Parasteatoda tepidariorum (XP_042900530.1), Varroa destructor (XP_022668058.1) und Trichonephila clavipes (GFY24485). .1) und Tropilaelaps mercedesae (OQR70008.1) (Abb. 1).

Ausrichtung der vorhergesagten Aminosäuresequenzen des Fructose-1,6-Bisphosphat-Aldolase-Proteins aus Haemaphysalis longicornis und anderen Arachnida-Arten. GenBank-Zugangsnummern: H. longicornis (ASV64058.1), Dermacentor silvarum (XP_037566647.1), Ixodes scapularis (XP_029847818.1), Amblyomma variegatum (DAA34561.1), Rhipicephalusmicroplus (XP_037283106.1), Trichonephila clavipe s (GFY24485.1 ), Parasteatoda tepidariorum (XP_042900530.1), Araneus ventricosus (GBN85837.1), Varroa destructor (XP_022668058.1) und Tropilaelaps mercedesae (OQR70008.1)

Die qRT-PCR-Ergebnisse zeigten, dass HlFBA in verschiedenen Entwicklungsstadien exprimiert wurde und dass seine Expression in erwachsenen Zecken signifikant höher war als in anderen Entwicklungsstadien (F = 7,196; df = 3, 8; P < 0,01; Abb. 2a). Darüber hinaus wurde HlFBA in allen nachgewiesenen Geweben weiblicher Zecken gefunden, wobei der Eierstock das höchste Expressionsniveau aufwies (F = 218,197; df = 3, 8; P < 0,01; Abb. 2b).

Expressionsmuster von HlFBA in verschiedenen Entwicklungsstadien (a) und verschiedenen Organen (b). Unterschiedliche Kleinbuchstaben über den Balken stellen signifikante Unterschiede innerhalb der Gruppe dar (P < 0,05). Kreise stellen einzelne Punkte jeder Gruppe dar. Alle Analysen wurden mit drei technischen und drei biologischen Replikaten durchgeführt. HlFBA, Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase-Gen aus Haemaphysalis longicornis

Das Molekulargewicht des rHlFBA-Proteins betrug etwa 62 kDa, wie durch SDS-PAGE bestimmt, wobei Trx aus dem leeren Plasmid 22 kDa ausmachte (Abb. 3a). Das rHlFBA-Protein wurde im Überstand stark exprimiert, 6 Stunden lang bei 25 ° C induziert und unter 200 mM Imidazol-Elutionsbedingungen gut gereinigt (Abb. 3b). Die Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass nur das rHlFBA-Protein positiv mit Kaninchen-Anti-H reagierte. longicornis-Serum, was auf seine immunogene Spezifität hinweist (Abb. 3c).

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot-Analyse von rHlFBA. eine SDS-PAGE der rHlFBA-Proteinexpression in Zellen des Stammes Escherichia coli BL21, induziert durch 0,5 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) bei 25 °C. Spuren: 1 Produktion des rHlFBA-Proteins ohne IPTG; 2, 3, 4, 5 Produktion von rHlFBA-Protein im Überstand mit IPTG bei 25 °C für 2, 4, 6 bzw. 8 Stunden; M-Markierung; 6, 7, 8, 9 Produktion des rHlFBA-Proteins bei der Fällung mit IPTG bei 25 °C für 2, 4, 6 bzw. 8 Stunden. b SDS-PAGE-Analyse der rHlFBA-Proteinelution. Bahnen: M-Markierung; 1 Produktion des rHlFBA-Proteins mit IPTG-Induktion; 2–6 rHlFBA-Protein, eluiert mit 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM bzw. 500 mM Imidazol. c Western-Blot-Analyse des rHlFBA-Proteins. Bahnen: M-Markierung; 1 gereinigtes rHlFBA über eine Ni-Säule, inkubiert mit Kaninchen-Anti-H. Longicornis-Serum; 2 IPTG-induzierte E. coli mit pET-32a(+)-HlFBA, inkubiert mit Kaninchen-Anti-H. Longicornis-Serum; 3 gereinigtes rHlFBA über eine Ni-Säule, inkubiert mit negativem Kaninchenserum. Pfeile zeigen das rHlFBA-Protein an. rH1FBA, rekombinante Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase aus Haemaphysalis longicornis

Die ELISA-Ergebnisse zeigten, dass der Antikörperspiegel der mit rHlFBA immunisierten Kaninchen mit zunehmender Immunisierungsdauer allmählich anstieg. Der Antikörperspiegel begann am 7. Tag nach der zweiten Impfung deutlich anzusteigen (F = 677,175; df = 2, 3; P < 0,01) und blieb bis zur dritten Impfung auf einem höheren Niveau (Abb. 4). Allerdings veränderten sich die Antikörperspiegel in der Trx-Gruppe und der PBS-Gruppe nicht signifikant (F = 677,175; df = 2, 3; P = 0,081).

Nachweis des Anti-rHlFBA-Antikörperspiegels (rekombinante Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase aus Haemaphysalis longicornis) im Kaninchenserum durch enzymgebundenen Immunosorbens-Assay. Pfeile geben die Impftage an. Unterschiedliche Kleinbuchstaben stellen signifikante Unterschiede innerhalb der Gruppe zum angegebenen Zeitpunkt dar (P < 0,05). Rote Kreise, blaue Quadrate und schwarze Dreiecke stellen die OD-Werte dar, die durch ELISA in der HlFBA-Gruppe, der Trx-Gruppe und der PBS-Gruppe zu unterschiedlichen Zeitpunkten ermittelt wurden. Alle Analysen wurden mit drei technischen und drei biologischen Replikaten durchgeführt

Am 10. Tag nach der dritten Immunisierung wurden weiße Neuseeland-Kaninchen mit erwachsenen Zecken infiziert. Die verschiedenen Parameter der PBS-Gruppe, der Trx-Gruppe und der rHlFBA-Gruppe wurden durch einfaktorielle ANOVA analysiert. Die Ergebnisse des Zeckenbefallsversuchs legten nahe, dass sich das Anschwellungsgewicht, die Eiablage und die Schlupffähigkeit zwischen der PBS-Gruppe und der Trx-Gruppe im Laufe der Zeit nicht signifikant veränderten (F = 5,258, P = 0,995; F = 9,331, P = 0,448; F = 80,895, P = 0,947; df = 2, 15 für alle; Tabelle 1). Verglichen mit der Trx-Gruppe betrug das mittlere (± Standardfehler) Gewicht der geschwollenen Zecken (F = 5,258; df = 2, 15; P < 0,05), die Eiablage (F = 9,331; df = 2, 15; P < 0,01) und das Ei -Die Schlupfraten (F = 80,895, df = 2, 15; P < 0,01) aus der rHlFBA-Gruppe betrugen 142,10 ± 25,09, 36,12 ± 13,68 und 59,65 ± 1,86 %, was einer Reduzierung um 22,6 %, 45,6 % und 24,1 % entspricht. jeweils. Die anhand der oben genannten Parameter berechnete geschätzte Immuneffizienz der Impfung mit rHlFBA betrug 68,4 %.

Fruktose-1,6-bisphosphat-Aldolase ist ein Schlüsselenzym bei der Glykolyse und Gluconeogenese und steht in engem Zusammenhang mit Lebensaktivitäten, Energiegewinnung und Stoffwechselaktivitäten von Organismen [14]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass es zusätzlich zu seiner normalen glykolytischen Rolle eine Rolle bei der Wirtsinvasion spielt [28]. In der vorliegenden Studie führten wir eine molekulare Charakterisierung von HlFBA aus H. longicornis durch und schätzten seine Wirksamkeit bei der Bereitstellung von Immunschutz für Kaninchen.

Prompipak et al. amplifizierte das FBA-Gen von Opisthorchis viverrini durch PCR und stellte fest, dass seine Sequenz in voller Länge 1089 bp lang war und 362 aa kodierte [15]. Li et al. charakterisierten die FBA von Clonorchis sinensis FBA und berichteten über drei ORFs (CsFBA-1, CsFBA-2 und CsFBA-3) mit Längen von 1089, 1092 und 1092 bp, die jeweils 362 aa, 363 aa und 363 aa kodierten [29]. In der vorliegenden Studie stimmte die Größe des von HlFBA aus H. longicornis kodierten Proteins mit den Angaben für parasitäre Trematodenarten überein. Das Sequenz-Alignment ergab, dass die Identität der Aminosäuresequenz zwischen HlFBA von H. longicornis und denen anderer Zecken > 89 %, aber < 81 % mit denen anderer Arachnida-Arten betrug, was mit ihrer evolutionären Verwandtschaft übereinstimmt.

Yang et al. detektierte die Transkription der Boten-RNA (mRNA) von Trichinella spiralis FBA (TsFBA) in allen Entwicklungsstadien von T. spiralis [30]. In der vorliegenden Studie zeigten die qRT-PCR-Ergebnisse, dass die HlFBA-Expression in verschiedenen Entwicklungsstadien von Zecken auftrat und bei Erwachsenen am höchsten war. Dies kann mit Unterschieden in der individuellen Größe und Stoffwechselaktivität zusammenhängen. Erwachsene Zecken sind größer, haben eine höhere Stoffwechselaktivität und einen höheren Energiebedarf, was möglicherweise der Grund dafür ist, dass die Expression in diesem Stadium am höchsten ist. Der Unterschied in der Expression in verschiedenen Geweben ist für die physiologische Funktion jedes Gewebes geeignet. Die höchste Expression von HlFBA im Eierstock könnte mit einem lebhaften Stoffwechsel und der höchsten Stoffwechselaktivität im frühen Stadium der Eibildung zusammenhängen. Der spezifische Mechanismus muss jedoch noch weiter untersucht werden.

Da FBA eine zentrale Rolle bei der Aktivität und dem Überleben von Parasiten spielt, gilt es als potenzieller Impfstoffkandidat oder chemotherapeutisches Ziel für die Behandlung [30]. In der Studie von Yang et al. zeigten die ELISA-Ergebnisse nach der Immunisierung von Mäusen mit dem rekombinanten T. spiralis FBA (rTsFBA) einen signifikanten Anstieg der IgG-Spiegel in der rTsFBA-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dies führte zu einer gemischten humoralen und zellulären Immunantwort T-Helfer 1/T-Helfer 2 (Th1/Th2), wobei Th2-Zellen vorherrschend waren, sowie zu stark erhöhten IgE-Spiegeln [30]. In einer anderen Studie entwickelten Mäuse, die mit dem rekombinanten FBA-Protein von Schistosoma mansoni immunisiert wurden, hohe Mengen an IgG oder IgG1 [31]. Ein ähnliches Ergebnis ergab sich in der vorliegenden Studie. Im Vergleich zur Kontrollgruppe stieg der Antikörperspiegel in der rHlFBA-Gruppe am 7. Tag nach der zweiten Impfung bis zur dritten Impfung signifikant an (P < 0,05). Daraus lässt sich schließen, dass die Immunisierung mit dem rHlFBA-Protein bei Kaninchen die Bildung einer humoralen Immunität induzieren kann.

Andere Studien haben auch die schützende Wirksamkeit von FBA gegen verschiedene Parasitenbefall nachgewiesen [31, 32]. Mit rTsFBA geimpfte Mäuse zeigten eine Verringerung der erwachsenen Wurmbelastung um 48,7 % und eine Verringerung der Muskellarvenbelastung um 52,5 % [30]. Diese Daten zeigten, dass TsFBA ein wirksames Antigen für die Entwicklung eines Impfstoffs gegen T. spiralis-Infektionen ist. Marques et al. verband das Gen von S. mansoni FBA mit dem pGEX-4 T-3-Plasmid und sein Fusionsprotein wurde in E. coli produziert [31]. Die Immunisierung von Mäusen mit diesem Antigen führte zu einem signifikanten Schutz (57 %) gegen eine Cercarieninfektion und die Bildung von hepatischen Granulomen nahm deutlich ab [31]. Das FBA von erwachsenen S. mansoni reduziert auch die Bildung von S. mansoni-Lebergranulomen in immunisierten Mäusen. FBA spielt eine zentrale Rolle bei der Glykolyse und ist wichtig für die Energieproduktion, die für verschiedene Schistosomenaktivitäten und das Überleben erforderlich ist, und ist daher zu einem Ziel für Interventionen geworden [33,34,35]. Diese Ergebnisse unterstützen den Einsatz von FBA als vielversprechender Impfstoffkandidat gegen Parasiten. Unsere statistische Analyse ergab, dass die Immuneffizienz von rHlFBA 68,4 % betrug. Im Vergleich zur Kontrollgruppe sanken das Gewicht der Zecken, die Eiablage und die Brutrate der Eier in der rHlFBA-Gruppe signifikant um 22,6 %, 45,6 % bzw. 24,1 % (P < 0,05). Eine frühere Studie zeigte, dass Antikörper im Wirtsblut den Mitteldarm von Rhipicephalus appendiculatus durchqueren und die Bindungsaktivität innerhalb der erwachsenen Frau beibehalten können [36]. Es kann angenommen werden, dass Antikörper an das HlFBA-Protein in der Zecke binden und den Verlust der FBA-Funktion auslösen könnten. Dies würde dazu führen, dass die Zecke nicht in der Lage wäre, auf normale Weise Energie zu gewinnen. Dieser Energieverlust könnte sich in einer Verringerung des Zeckengewichts, der Eiablage und der Eischlüpfrate von H. longicornis-Zecken äußern.

In einer früheren Studie fanden wir heraus, dass der Immunschutz der Triosephosphat-Isomerase (TIM) in H. longicornis (HlTIM) 50,8 % betrug [23]. Die vorliegende Studie zeigte, dass die Impfstoffeffizienz von HlFBA (68,4 %) höher ist als die von HlTIM. Höhere Antikörpertiter korrelieren mit dem Schutz des Wirts gegen Zeckenbefall [37]. Diese Schlussfolgerung wurde durch den höheren Antikörperspiegel der HlFBA-Gruppe aus den Ergebnissen des ELISA in unseren Studien bestätigt. Daher waren die Reduktionsraten von drei Parametern (Anschwellgewicht, Eiablage, Schlupfbarkeit) in der HlFBA-Gruppe (22,6 %, 45,6 % und 24,1 %) höher als in der HlTIM-Gruppe (8,6 %, 35,4 % und 17,3 %). Darüber hinaus waren die physiologischen Funktionen von FBA- und TIM-Antigenen unterschiedlich und der Grad der durch Antikörper vermittelten Funktionsschädigung war unterschiedlich. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das FBA-Gen in vielen Zeckenarten hoch konserviert ist und dass dies für die Entwicklung eines Breitband-Anti-Zecken-Impfstoffs von Vorteil wäre. Die Kreuzreaktivität dieses Proteins mit anderen Zeckenseren und damit verbundenen Immunisierungsexperimenten sollte analysiert werden, um seine Machbarkeit für die Impfstoffentwicklung zu bewerten.

Das rHlFBA-Protein kann Kaninchen insbesondere vor einer Infektion mit H. longicornis schützen. Die Impfung mit Einzelantigen-FBA kann die physiologischen Reaktionen von Zecken hemmen, die normale Entwicklung weiblicher Zecken beeinträchtigen und den Wirt schützen. Die Untersuchung von Enzymen, die am Glukosestoffwechsel beteiligt sind, könnte dazu beitragen, die Entwicklung eines Breitbandimpfstoffs gegen Zecken voranzutreiben.

Die Daten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im Artikel enthalten.

Enzymimmunoassays

Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase

FBA aus Haemaphysalis longicornis

Meerrettich-Peroxidase

Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid

Leserahmen öffnen

Polyvinylidendifluorid

Quantitative Echtzeit-PCR

Rekombinantes HlFBA-Protein

TBS-Tween-20

Thioredoxin

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Wir danken Hui Wang vom College of Life Sciences der Hebei Normal University für die hervorragende technische Unterstützung.

Diese Studie wurde von der Hebei Natural Science Foundation (C2021205010) und der Hebei Normal University Foundation (L2020Z06) unterstützt.

Yuan-Yuan Cao und Shu-Wen Xiao haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Schlüssellabor für Molekular- und Zellbiologie des Bildungsministeriums, Hebei Schlüssellabor für Tierphysiologie, Biochemie und Molekularbiologie, Hebei Collaborative Innovation Center for Eco-Environment, College of Life Sciences, Hebei Normal University, Shijiazhuang, 050024, China

Yuan-Yuan Cao, Shu-Wen Xiao, Feng Yang, Xiao-Ya Liu, Hui Lu und Yong-Hong Hu

Shijiazhuang Post and Telecommunication Technical College, Shijiazhuang, 050021, China

Jin-Cheng Zhang

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YHH plante und organisierte die Studie und verfasste die endgültige Fassung. YYC und SWX haben das Manuskript verfasst. YYC, FY und XYL führten die Experimente und die Datenanalyse durch. HL und JCZ sammelten Proben und beteiligten sich an der Zeckenfütterung. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Yong-Hong Hu.

Diese Studie wurde von der Tierethikkommission der Hebei Normal University als im Einklang mit dem Tierschutzgesetz der Volksrepublik China genehmigt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Cao, YY., Xiao, SW., Yang, F. et al. Molekulare Charakterisierung und Immunwirksamkeit der Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase aus Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Parasites Vectors 16, 169 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05794-1

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Eingegangen: 29. Januar 2023

Angenommen: 02. Mai 2023

Veröffentlicht: 25. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05794-1

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